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Cistro磁力架的應(yīng)用之IP免疫沉淀篇

來源:上海墨芊生物科技有限公司   2025年03月18日 14:02  

  免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)有廣義和狹義之分,廣義的免疫沉淀包括特定目標(biāo)蛋白質(zhì)免疫沉淀(IP)、蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫沉淀(Co-IP)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和RNA免疫沉淀(RIP),狹義的免疫沉淀是指特定目標(biāo)蛋白質(zhì)的免疫沉淀,也就是常說的IP實驗,IP實驗可從含有多種不同蛋白質(zhì)的樣品中分離濃縮特定的蛋白質(zhì)。

 

免疫沉淀原理

免疫沉淀是一種利用特異性抗體結(jié)合抗原,并通過沉淀富集的方式從復(fù)雜的樣本中分離出目標(biāo)蛋白的方法。主要用于從復(fù)雜的生物樣本中分離和純化單一特定蛋白質(zhì),依賴于抗體對目標(biāo)蛋白的特異性識別并形成抗原-抗體復(fù)合物,然后通過物理方法(如瓊脂糖珠或磁珠 )將這些復(fù)合物沉淀下來,再結(jié)合Western blot(WB)或質(zhì)譜(mass spectrum,MS)對目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測分析,即可對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性/定量分析。

磁珠的優(yōu)勢

結(jié)合能力和得率

目前磁性微粒已經(jīng)大幅取代瓊脂糖,成為免疫沉淀和其他微量親和純化方法的支持物。磁性微粒是球形固體,抗體結(jié)合于每個磁珠的表面。雖然磁珠不具有多孔中心以增加結(jié)合能力的優(yōu)勢,但它們明顯小于瓊脂糖微珠(直徑0.2-4 μm),可提供足夠大的總表面積以滿足高容量的抗體結(jié)合,并且抗體很少會在溫和的洗滌步驟(磁體)中丟失。因此,盡管磁珠的抗體結(jié)合能力低于瓊脂糖,但最終的抗原得率通常與瓊脂糖相等或比瓊脂糖更高。

可重復(fù)性和純度

使用瓊脂糖時,難以在不破壞和靠近一些沉淀樹脂的前提下移除緩沖液。使用磁珠時,強(qiáng)力磁力架可將磁珠固定在管壁,所以無需碰觸磁珠沉淀即可移除緩沖液。此外,瓊脂糖通常需要較長的孵育時間(使溶液向內(nèi)部空間的擴(kuò)散)和預(yù)純化步驟(控制非目標(biāo)蛋白的非特異性結(jié)合)。由于所有的相互作用均發(fā)生在磁珠的外表面,并且磁珠的尺寸更均一,所以磁珠的可重復(fù)性和純度通常高于瓊脂糖。

簡單、快速和自動化

瓊脂糖和磁珠之間的上述差異正是目前免疫沉淀優(yōu)先選擇磁珠的原因。由于瓊脂糖免疫沉淀需要較長的孵育時間、預(yù)純化步驟和多次離心,所以其需要大量手動操作,總時間為1-1.5小時。相反,一次磁珠免疫沉淀使用只需大約30分鐘即可完成。此外,由于磁性分離不需要離心,在處理多個樣品時更簡單、更快速,更適合自動化。

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