BioAuxilium/THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒方案
夾心法TR-FRET免疫檢測法,用于細胞裂解液中磷酸化4EBP1(T37/T46)的半定量檢測。完整的檢測驗證信息可在技術資料表中查閱。詳細的檢測操作步驟描述于通用用戶手冊中。檢測性能的對比分析展示在更新后的應用說明書中。
艾美捷BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒組分:
Eu-磷酸化4EBP1抗體(25 µL)
Acc-磷酸化4EBP1抗體(100 µL)
4EBP1對照裂解液(200 µL)
5倍濃縮裂解緩沖液2(5 mL)
10倍濃縮TR-FRET檢測緩沖液(250 µL)
100倍濃縮磷酸酶抑制劑混合液(250 µL)
BioAuxilium-THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒(#KIT-4EBP1P-500)配套試劑:
THUNDER™ 4EBP1對照裂解液
THUNDER™裂解緩沖液2(5倍濃縮)
THUNDER™ TR-FRET檢測緩沖液(10倍濃縮)
THUNDER™磷酸酶抑制劑混合液(100倍濃縮)
THUNDER磷酸-4EBP1(T37/T46)TR-FRET細胞信號檢測試劑盒檢測原理:
磷酸化4EBP1(T37/T46)檢測試劑盒是一種均相時間分辨熒光共振能量轉移(TR-FRET)夾心免疫檢測法(見圖1)。THUNDER™細胞信號傳導檢測工作流程包含3個步驟(見圖2)。在細胞處理后,首先使用試劑盒中提供的特定裂解緩沖液將細胞裂解。然后,通過一對熒光標記的抗體以簡單的“加入-孵育-測量”格式(單步試劑添加;無需洗滌步驟)檢測細胞裂解液中的磷酸化4EBP1(T37/T46)。其中一個抗體標記有供體熒光團(銪螯合物;Eu-Ab1),另一個抗體標記有遠紅接受體熒光團(FRAb2)。兩種標記抗體結合到目標蛋白上不同的表位,使兩種染料靠近。使用閃光燈(320或340 nm)或激光(337 nm)激發供體銪螯合物分子時,會觸發從供體到接受體分子的FRET,接受體分子隨后在665 nm處發射TR-FRET信號。銪螯合物的剩余能量在615 nm處產生光。665 nm處的信號與細胞裂解液中磷酸化4EBP1(T37/T46)的濃度成正比。數據可以表示為665 nm處的信號,或665 nm/615 nm的比值。
圖1:TR-FRET細胞信號測定原理的示意圖。
圖2:使用2板(轉移)協議的檢測工作流程。
試劑盒性能對比——與其他TR-FRET技術的比較
作為檢測驗證的一部分,THUNDER™磷酸化4EBP1(T37/T46)檢測試劑盒與一種競爭性TR-FRET檢測技術(公司A)進行了性能對比。具體而言,兩種不同的檢測方法在檢測A431細胞經PP242處理后基礎磷酸化4EBP1(T37/T46)抑制的能力上進行了并排比較,實驗采用雙板檢測協議。所有試劑均按照各自制造商的推薦進行準備。細胞處理后,使用相應試劑盒的1X補充裂解緩沖液將細胞裂解。隨后,裂解液在同一塊384孔檢測板上按照相應試劑盒的標準協議進行測試。在孵育4小時后,使用EnVision®(閃光燈激發)讀取結果。數據顯示,兩種TR-FRET檢測方法表現出相當的靈敏度(IC50值)和信背比(S/B)。
艾美捷科技是BioAuxilium的中國區域合作伙伴,為科研工作者提供優質的產品與服務。
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