鳥氨酸轉氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

脯氨酸是植物體內適應逆境脅迫的一種重要的滲透調節(jié)物質。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同，分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥氨酸轉氨酶( δ-OAT) 是 是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關鍵酶，對植物適應逆境脅迫起關鍵作用。

測定原理：

鳥氨酸和α-酮戊二酸在鳥氨酸轉氨酶和 NADH 作用下發(fā)生氨基轉移反應生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同時產生NAD，通過檢測 340nm 處的吸光度的變化可反映出鳥氨酸轉氨酶活性的高低。

組成：

試劑二臨用前加 8ml 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存。試劑三臨用前加 8ml 試劑一充分溶解；用不完的試劑 4℃保存。試劑四臨用前每瓶加 4ml 試劑一充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、研缽、酶標儀、96 孔板。

酶液提取：

1、組織：按照質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置冰上待測。

2、細胞：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 4℃，10000g離心 10min，取上清置冰上待測。 3、液體：直接檢測。

測定操作：

1、酶標儀預熱 30min，調節(jié)波長至 340nm。

2、將配好的試劑二、三、四 37℃預熱 5min。（注意：粉劑試劑需要自行配制）

3、取 96 孔板，依次加入 60μl 試劑二，60μl 試劑三，60μl 試劑四，20μl 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm

處初始吸光值和 37℃反應 10min 的吸光值A2，△A=A1-A2。

計算公式：

用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3） 按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 10⁴ 個細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OAT（nmol/min /ml）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T

=321.54×ΔA

V 反總：反應體系總體積，0.2ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g