導讀

藥物免疫毒性可以定義為非預期的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)。免疫抑制可能導致宿主對傳染源或腫瘤細胞的抵抗力下降，而免疫增強可能會加劇自身免疫性疾病或過敏反應。藥物誘導的全身免疫激活可導致與細胞因子過度釋放相關的嚴重反應，也稱為細胞因子風暴。由于免疫系統(tǒng)的功能具有高度的物種特異性，因此很難通過動物研究來預測人類細胞因子的釋放。全血檢測在藥物開中屬于易于操作的體外解決方案。能快速簡單地監(jiān)測人類細胞因子釋放，從而預測藥物的功效和安全性。相比基于PBMC的測定更科學、更便捷，不需要純化和分離細胞。少量血液（<5mL）足以測試多種實驗條件。

研究內(nèi)容

這項研究選擇免疫途徑和相關激動劑來靶向Toll樣受體途徑、STING途徑或TCR激活途徑。最后通過HTRF定量人IL1β、IL2、IL6、IL8、TNFα和IFNγ。此外，將HTRF數(shù)據(jù)與ELISA參考試劑盒獲得的數(shù)據(jù)進行比較，以評估兩種技術之間的相關性。

來自3位不同獻血者的新鮮血液被收集在肝素管中，并且全血樣品均質(zhì)化后在RPMI中稀釋。將化合物分配到96孔板中，然后添加預稀釋的全血樣品。在37°C下孵育過夜，收集上清液，按表1所示稀釋全血上清液。最后使用HTRF或ELISA測量細胞因子。

表1：實驗條件：U:未處理；H:HKLM；L:脂多糖；Z:酵母聚糖；R:R848；C:cGAMP；PI:PMA/離子霉素；PHA:植物血凝素；O/C:Okt3/抗CD28抗體

實驗結果

01

Toll樣1、2、4、6受體的激活

用HKLM、LPS或酵母聚糖刺激Toll樣受體途徑。下圖顯示了未處理樣品與處理樣品中每種測量細胞因子的濃度。HTRF解決方案能夠測定所有樣品中的基礎細胞因子水平（虛線）以及測量細胞因子分泌的增加。

02

STING通路的激活和T細胞受體途徑的激活

2,3cGAMP是STING途徑的特異性激活劑。激活后的細胞因子分泌譜顯示TNFα、IL1β和IL6顯著增加。相反，IFNα、IL2或IL8沒有顯著反應（下圖）。圖6顯示OKT3/抗CD28刺激全血中的T細胞誘導輕微的IFNγ釋放，但未能誘導任何IL2產(chǎn)生。然而，對照條件PHA或PMA/離子霉素誘導IL2和IFNγ細胞因子的強烈增加。這些數(shù)據(jù)表明OKT3/CD28并沒有產(chǎn)生強烈T細胞特異性反應。

03

HTRF和ELISA檢測之間的相關性

由于ELISA方法仍然是生物體液中細胞因子測量的傳統(tǒng)常用方法，因此本研究將HTRF獲得的細胞因子濃度與ELISA測定獲得的細胞因子濃度進行比較。來自3個不同供體的全血樣本首先在地塞米松存在/不存在的情況下用R848（TLR 7/8激活）進行刺激。通過HTRF或ELISA進行R848+/-地塞米松處理后IL8釋放的測量，并確定兩種化合物的EC50或IC50。下圖顯示了HTRF和ELISA人IL8測定之間在164個樣品上獲得的相關性。在這里，研究證明了兩種檢測之間具有非常好的相關性，相關值r=0.993，比例偏差為0.77。

然后研究比較了通過HTRF和ELISA在3個不同供體上獲得的R848和地塞米松藥理劑量反應（下圖）。結果表明，兩種方法測得的R848的EC50值或地塞米松的IC50值也非常接近（見表2）。

隨著免疫腫瘤學或代謝疾病等領域的研究和藥物發(fā)現(xiàn)的快速發(fā)展，監(jiān)測免疫系統(tǒng)對治療的反應比以往任何時候都更加重要。全血檢測是一種用于評估對治療免疫反應簡單而強大的體外工具。HTRF細胞因子檢測具有免洗方案、低樣品消耗和廣泛的動態(tài)范圍，與ELISA相比，可以增加測試化合物的數(shù)量，并快速獲得全血中細胞因子分泌的數(shù)據(jù)，為在生理環(huán)境中測試化合物創(chuàng)造了理想的方法平臺。