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PCR電泳原理與分析

來(lái)源:上海撫生實(shí)業(yè)有限公司   2024年12月03日 14:59  

PCR電泳原理:

PCR電泳PCR電泳主要是瓊脂糖凝膠電泳。電泳儀有正負(fù)極的,而DNA是帶負(fù)電荷的。故而向正方向移動(dòng)。

然后DNA里是有堿基的。堿基可以吸收紫外光。最重要的是有染色劑,常用的有溴化乙錠等等。一般在配制凝膠的時(shí)候會(huì)加進(jìn)去,或者跑完電泳然后將凝膠浸在含有染色劑的溶液里,染色劑可以插入DNA鏈中。在可見(jiàn)光下是看不見(jiàn)條帶的,但在紫外光照射下就能出現(xiàn)條帶。

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PCR擴(kuò)增后一般進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,電泳后一般有以下幾種條帶:

1、引物帶。引物濃度過(guò)高或是擴(kuò)增效率不是特別高時(shí)都會(huì)有,一般不呈現(xiàn)為細(xì)帶,為發(fā)散狀;如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮,可以考慮適當(dāng)降低引物量。

2、引物二聚體帶。比引物跑得慢一點(diǎn),條帶清晰,但如果擴(kuò)增產(chǎn)物小于100bp時(shí),產(chǎn)物與引物二聚體就不好分別了,建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳(不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳);如果引物二聚體在優(yōu)化復(fù)性溫度后仍然嚴(yán)重影響目的產(chǎn)物的擴(kuò)增,優(yōu)先考慮更換引物設(shè)計(jì)(因?yàn)橐锖铣傻某杀颈确磸?fù)優(yōu)化條件的成本低)

3、目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計(jì)大小相同,條帶清晰。

4、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計(jì)大小不相同,條帶清晰。一般考慮通過(guò)提高復(fù)性溫度來(lái)減少或消除(也可用溫度梯度功能來(lái)尋找的復(fù)性溫度,東勝龍811PCR儀就有此功能)。如果其片段大小比目的片段大較多,可以通過(guò)減少延伸時(shí)間來(lái)減少或消除(即不給它足夠的延伸時(shí)間)。還有一種非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶是來(lái)自于逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)的基因組DNA的污染,如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物中有內(nèi)含子,擴(kuò)增產(chǎn)物很可能大于目的基因。這種條帶通過(guò)優(yōu)化復(fù)性溫度是不能消除的,可以在逆轉(zhuǎn)錄前用無(wú)RNA酶的DNA酶進(jìn)行樣本處理。

5、模板DNA帶。模板濃度過(guò)高時(shí)可能出現(xiàn)。如果是基因組DNA為模板,條帶可能會(huì)很亂且較大。一般進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),模板濃度都不要太大,否則會(huì)產(chǎn)生一些比目的基因長(zhǎng)一點(diǎn)的雜質(zhì)DNA(可能不成條帶,也看不到),這是由PCR擴(kuò)增原理造成的。

分析PCR電泳圖:

1. 首先需要的是marker,即有既定片段長(zhǎng)度的DNA片段。

2. 看膠,里點(diǎn)樣孔越近的DNA片段長(zhǎng)度越大,離點(diǎn)樣孔遠(yuǎn)的DNA片段長(zhǎng)度小。以圖片看,5.6兩個(gè)孔的片段比前邊4個(gè)孔的片段短,如果你知道前邊4個(gè)孔的片段長(zhǎng)度,可以估計(jì)一下。

條帶上方的模糊的一片應(yīng)該是引物二聚體來(lái)的。做連接或者其他操作前用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收一下,就可以去掉引物二聚體了。

 


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