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流式細胞儀怎么分選T細胞?

來源:天津益元利康生物科技有限公司   2024年11月18日 10:32  

上文介紹了流式細胞術的原理及應用,今天讓我們學習一下怎么用流式細胞儀分選T細胞吧~

一、樣本制備

1.取樣100μL抗凝血。

2.標記:根據(jù)抗體說明書標記實驗管。混勻后,室溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血:將10×裂紅液用水稀釋10倍,每管加入1mL,振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘,300g4°C離心5分鐘。

4. 洗滌:棄去上清,加入1mL 1×PBS洗液,300g離心洗滌5分鐘,洗2-3次。

5. 上機檢測:棄去上清后加入500μL 1×PBS,混勻懸浮后過濾,避光等待上機檢測。

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二、儀器操作

1. 打開流式細胞儀、開啟液流、質(zhì)控。

2. 分選前設置:共包含兩個步驟,第一,調(diào)節(jié)合適的液流斷點,待四路窗口形成清晰的5路液流,其中含4個收集液流,一個廢液流后,利用“sweetspot”鎖住此斷點;然后利用Accudrop 珠子,調(diào)整 “Drop Delay”時間,當左側(cè)液流接近 100%,而且保持相對穩(wěn)定的范圍的時間是最佳時間。

3. 設置分析條件:完成質(zhì)控后,建立用戶文件夾、當日實驗文件夾,根據(jù)細胞標記,選擇所需參數(shù),根據(jù)各抗原之間生物關系及實驗主要關注點,畫好 FSC-SSC及各熒光參數(shù)兩兩相對的散點圖,根據(jù)抗原生物關系設置分析門,及群級聯(lián)關系表。

4. 確定電壓:先上對照管,根據(jù)淋巴細胞在 FSC-SSC散點圖中的位置,調(diào)整 FSCSSC兩個參數(shù)的電壓,保證淋巴、單核及中心粒細胞呈現(xiàn)在合適的位置,然后設置P1 門圈住淋巴細胞;根據(jù)陰性細胞群位置,調(diào)整好其它熒光參數(shù)的電壓,記錄10000個細胞。

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5. 分類計數(shù):上陽性管,通過分級設門,完成各抗原之間生物關系的呈現(xiàn),及各細胞分類計數(shù)情況。

6. 分選設置:在“sort layout”窗口,設置收集裝置和純度模式,然后設置分選門,圈住CD4CD8 陽性的細胞,將分選門分別填入左右“sort location field” 框中。

7. 分選:將收集管中分別裝200ul 1XPBS,放入儀器分選倉下面的收集管架上:點“sort”開始分選,此時“sort location field”框中可見所獲得的CD4CD8陽性的細胞數(shù)目;收集到足夠的目的細胞后,停止分選。

8.細胞純度檢測:利用上樣針清洗液和水清洗上樣針,直到以水上樣時,FSC-SSC散點圖中無點為止。將分選獲得的CD4陽性細胞上樣回測,觀察細胞分選純度;再次清洗上樣針,將分選獲得CD8陽性細胞上樣回測,觀察細胞分選純度。

 

通過以上實驗步驟,我們可以成功分選并收集到特定的T細胞群體。

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