在癌癥研究中，非侵入性功能成像已成為評估腫瘤發展和治療效果的重要工具。腫瘤缺氧與腫瘤的侵襲性和預后密切相關，是監測癌癥進展的關鍵參數之一。近年來，光聲（Photoacoustic, PA）成像技術因其能夠結合高頻率超聲（Ultrasound, US）實現解剖學和功能性信息的并行收集，逐漸在臨床前研究中展現出應用潛力。光聲成像通過激光脈沖激發分子產生熱彈性波，這些波可以被超聲接收器檢測，從而實現對深層組織內光吸收分子的高分辨率成像。

艾美捷Hypoxyprobe Omni Kit試劑盒（HP3）的應用：

在實驗中，為了可視化缺氧區域，研究團隊使用了Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒（Hypoxyprobe Inc.生產，貨號：HP3）。該試劑盒包含Pimonidazole HCl和親和純化的兔抗Pimonidazole抗體（PAb2627AP）。Pimonidazole是一種乏氧細胞標記物，能夠在缺氧條件下與細胞內蛋白質結合，形成穩定的加合物。通過腹腔注射Pimonidazole后，可以使用PAb2627AP抗體進行免疫組化染色，從而可視化組織中的缺氧區域。

解析文章《Real-Time Assessment of Tissue Hypoxia In Vivo with Combined Photoacoustics and High-Frequency Ultrasound》

作者：

Marco Gerling 1* , Ying Zhao 2,3* , Salvatore Nania 3 , K. Jessica Norberg 3 , Caroline S. Verbeke 4 , Benjamin Englert 1 , Raoul V. Kuiper 6 , ?sa Bergstr?m 1 , Moustapha Hassan 5 , Albrecht Neesse 7 , J. Matthias L?hr 1,3 , Rainer L. Heuchel 1,3 *

具體實驗步驟：

腫瘤模型建立：研究團隊使用了小鼠胰腺癌（KPC細胞系）和結腸癌（通過AOM和DSS誘導）模型。

成像與數據采集：使用VisualSonics Vevo 2100 LAZR成像系統對小鼠進行PA和B模式US成像。在PA成像中，采用750 nm和850 nm的雙波長激光脈沖，測量氧合血紅蛋白（HbO?）和脫氧血紅蛋白（Hb）的濃度，進而計算組織氧飽和度（sO?）。在成像前，通過腹腔注射Pimonidazole，隨后在成像后進行免疫組化分析，以驗證PA成像結果的準確性。

免疫組化分析：切除腫瘤組織，用4%甲醛固定過夜，并進行石蠟包埋切片。

使用PAb2627AP抗體進行免疫組化染色，檢測Pimonidazole與缺氧細胞內蛋白質的加合物。使用ImageJ軟件量化棕色染色強度，以評估缺氧程度。

實驗結果：

實時光聲成像檢測小鼠器官氧合度變化

通過改變小鼠的氧氣供應，研究團隊證明了PA系統能夠實時檢測組織氧合度的變化。當氧氣供應從醫用空氣（21% O?）增加到純氧（100% O?）時，PA成像顯示肝臟實質和胃壁的氧合度均有所增加，且肝臟實質的氧合度增加更為迅速和顯著。當氧氣供應恢復到醫用空氣時，氧合度也隨之恢復正常。

腫瘤缺氧檢測及與組織學評估的相關性

在胰腺癌和結腸癌模型中，PA成像能夠準確識別缺氧區域，并與免疫組化染色結果高度一致。例如，在胰腺癌模型中，PA成像能夠清晰顯示腫瘤內的缺氧區域，而免疫組化染色也證實了這些區域的缺氧狀態。通過線性回歸分析，研究團隊發現PA測量的氧飽和度與Pimonidazole染色強度之間存在顯著的正相關關系（r=0.91, p=0.0028）。

光聲成像與靜脈造影的互補性

為了評估腫瘤灌注情況，研究團隊在PA成像的基礎上結合了靜脈造影。通過靜脈注射微泡造影劑，并實時跟蹤其在腫瘤內的分布和清除情況，研究團隊能夠同時獲取腫瘤的氧合度、灌注情況和解剖結構信息。這種雙模態成像方法為縱向實時監測腫瘤血管生成和治療反應提供了有力的工具。

胰腺皮下腫瘤異種移植物腫瘤缺氧的評價。A)缺氧s.c腫瘤的典型氧-血紅蛋白PA圖像。b模式圖像（左圖）和氧飽和度圖（氧- hemo PA成像，右圖）并排放置，顯示相同的成像窗口。熱圖表示氧飽和度水平，范圍從100%（紅色）到0%（深藍色）。低于總Hb定義閾值（最大強度的20%）的斑點為黑色（見方法）。黃線代表腫瘤區域。B)同一s.c.腫瘤的代表性缺氧染色（棕色）。黑線表示腫瘤區域。C)圖2A所示缺氧s.c腫瘤的代表性H&E染色。D)非缺氧性s.c腫瘤的典型氧血紅蛋白圖像。b模式圖像和氧飽和度圖

（氧合血紅光聲圖像放置在右側顯示相同的成像窗口）。熱圖如上所示。黃線代表腫瘤區域。E)非缺氧s.c腫瘤的代表性吡莫硝唑染色，因此缺乏棕色染色，如圖2D所示。黑線表示腫瘤區域。F)具有代表性的非缺氧性sc腫瘤的H&E染色。G)基于pa的so2測量和相應的吡硝唑染色強度線性回歸分析的圖形表示。將吡莫硝唑強度歸一化，將數據集中的最高值調整為100，將z低強度設置為0。95%置信區間的置信帶如圖（虛線）所示。

結論：

本研究表明，雙波長PA成像技術能夠實時、可靠地檢測小鼠腫瘤模型中的缺氧區域，并與免疫組化結果高度一致。通過結合B模式US和靜脈造影技術，該方法還能夠提供關于腫瘤灌注和解剖結構的詳細信息。因此，雙模態PA/US成像技術在臨床前癌癥研究中具有廣泛的應用前景，可用于實時監測腫瘤生長和治療反應。