II型膠原蛋白在膠原蛋白家族中d特，其組織分布僅限于無血管組織，如軟骨和眼球的玻璃體。由于II型膠原蛋白可以在實(shí)驗(yàn)動物中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，因此在某些自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中，懷疑存在對II型膠原蛋白的自身免疫反應(yīng)，這些疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、與RA相關(guān)的眼部疾病，以及影響特定含有II型膠原蛋白的組織的復(fù)發(fā)性多軟骨炎。

II型膠原蛋白檢測試劑盒（編號：6018）旨在通過ELISA定量來自人類、猴子、豬、牛、鼠類、兔子、馬、狗和小雞等不同物種的可溶性天然II型膠原蛋白，適用于細(xì)胞培養(yǎng)樣本或組織標(biāo)本。該試劑盒可選擇在1步或2步程序中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和檢測抗體步驟（檢測大綱）。Chondrex建議使用1步方案以節(jié)省時間。然而，2步檢測協(xié)議與Chondrex I型膠原蛋白檢測試劑盒的協(xié)議相同，兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本結(jié)果可比較。請使用適合您研究的協(xié)議。

ELISA檢測試劑盒用于定量多種物種的II型膠原蛋白。

艾美捷II型膠原蛋白檢測試劑盒，多物種：

貨號：6018

格式：96孔ELISA板，帶可拆卸條。

檢測類型：夾心ELISA。

檢測時間：

1步法：3.5小時；

2步法：5.5小時。

標(biāo)準(zhǔn)范圍：200 ng/ml - 3.1 ng/ml。

樣本數(shù)量：每板最多可處理40個（重復(fù)）樣本。

樣本類型：溶解膠原蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)基。

推薦樣本稀釋：1:1 - 1:1000。

著色劑：OPD（在490 nm讀取）。

存儲：-20°C，保存12個月。

驗(yàn)證數(shù)據(jù)：組內(nèi)重復(fù)（2.1-4.4%）/組間重復(fù)（6.3-9.3%）/加標(biāo)測試（86-97%）。

注釋：該試劑盒可選擇在1步或2步程序中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和檢測抗體步驟的操作。

溶解膠原蛋白：

為通過ELISA測定培養(yǎng)細(xì)胞層和組織中的膠原蛋白含量，需要對膠原蛋白進(jìn)行溶解。對于組織標(biāo)本，強(qiáng)烈建議使用少量胃蛋白酶進(jìn)行原膠原的制備，因?yàn)槠渌行缘鞍酌福缫鹊鞍酌负湍竟系鞍酌福瑫⒛z原蛋白消化為小肽。胃蛋白酶只會消化膠原分子N端和C端的肽段，而無法消化膠原分子的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域。

通過有限的胃蛋白酶消化從組織中溶解膠原蛋白（通常膠原蛋白與胃蛋白酶的比例為100:1）取決于組織類型和分子內(nèi)及分子間交聯(lián)的含量。例如，骨頭和跟腱對胃蛋白酶消化具有抵抗性，只有10-20%的膠原組織會被溶解。小牛皮膠原蛋白在24-48小時內(nèi)可被胃蛋白酶w全溶解，而成年皮膚的溶解時間則需7-9天。對胃蛋白酶抗性不溶膠原可通過堿性處理溶解。將不溶膠原懸浮在含10% Na2SO4和0.1M胺類化合物（如Tris）的冷0.1N NaOH溶液中，并在4°C下培養(yǎng)1-2周。處理完后用HCl中和pH至5.0，再用0.05M醋酸或中性緩沖液（如0.1M Tris-0.3M NaCl，pH 7.5）稀釋。

因此，個體樣本的最佳溶解條件應(yīng)在處理樣本之前確定。膠原蛋白可以在非還原條件下通過6% SDS凝膠進(jìn)行分析，以真實(shí)的I型膠原作為標(biāo)準(zhǔn)。如果樣本中出現(xiàn)比γ鏈（分子量=300 Kd）更大的帶，樣本必須進(jìn)一步用胃蛋白酶或彈性酶消化，這將消化分子內(nèi)及分子間的膠原交聯(lián)。另一方面，如果在α鏈（分子量=100 Kd）下觀察到較小的帶或拖尾帶，可能是樣本過度消化。因此，了解各個膠原樣本的生物和物理化學(xué)特性至關(guān)重要。

計(jì)算結(jié)果：

對空白（B）、標(biāo)準(zhǔn)和測試樣本的重復(fù)OD值進(jìn)行平均。

從標(biāo)準(zhǔn)和測試樣本的平均OD值中減去平均的空白OD值。

將標(biāo)準(zhǔn)的OD值與標(biāo)準(zhǔn)濃度（ng/ml）繪圖，使用對數(shù)/對數(shù)圖將數(shù)據(jù)線性化。圖1顯示了一個代表性實(shí)驗(yàn)，其中標(biāo)準(zhǔn)范圍為3.1-200 ng/ml，并比較了1步和2步協(xié)議。

測試樣本中膠原蛋白的ng/ml可以通過回歸分析計(jì)算。將其乘以樣本稀釋因子，以獲得原始樣本標(biāo)本中的膠原蛋白濃度（ng/ml）。

圖1 - II型膠原蛋白檢測ELISA試劑盒的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線