實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴(kuò)增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標(biāo)序列進(jìn)行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。

RT-qPCR原理的三個主要步驟：

1 、反轉(zhuǎn)錄：

1）、使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

2）、該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。

3）、反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。

2 、PCR擴(kuò)增：

1）、使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

2）、PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。

3）、PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。

3、 熒光實時檢測：

1）、使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。

2）、熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。

3）、使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量，從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。

根據(jù)所使用的技術(shù)不同，實時熒光定量PCR可以分為：熒光探針和熒光染料兩種方法。

現(xiàn)將其原理簡述如下：

 1. TaqMan熒光探針

    TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的shou選技術(shù)平臺。

2. SYBR熒光染料

    在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺?/span>DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是：

    ① 開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光；

    ② DNA變性時，SYBR染料釋放出來，熒光急劇減少；

    ③ 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR引物；

    ④ 聚合完成后，SYBR染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。

    實時熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)化學(xué)原理可以分為探針類和非探針類。探針類實時熒光定量 PCR 技術(shù)主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；非探針類實時熒光定量 PCR 技 術(shù)主要通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。無論是探針類實時熒光 定量 PCR 技術(shù)還是非探針類實時熒光定量 PCR 技術(shù)，檢測的都是 擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量。但探針類實時熒光定量 PCR 技術(shù)增加了識別 探針的具體的流程，操作的難度較大。