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Spherisorb色譜柱的安裝、平衡和初始柱效測(cè)試

來(lái)源:廣州信譜徠科學(xué)儀器有限公司   2024年09月03日 09:01  

Spherisorb色譜柱的安裝、平衡和初始柱效測(cè)試

 

 Spherisorb分析柱耐用、柱效高,出現(xiàn)在數(shù)千篇色譜參考文獻(xiàn)中。色譜柱長(zhǎng)度和直徑范圍廣,在優(yōu)化方法和減少溶劑消耗方面為您提供了極大的靈活性。按照本手冊(cè)中的指導(dǎo),從您的分析色譜柱和保護(hù)柱中獲得最佳性能、再現(xiàn)性和耐用性。

 每根Spherisorb色譜柱都附帶一份性能測(cè)試色譜圖。此性能測(cè)試色譜圖會(huì)提供每根色譜柱的以下信息:凝膠批號(hào)、色譜柱序列號(hào)、USP理論塔板數(shù)、USP拖尾因子、容量因子以及色譜條件。請(qǐng)妥善保存性能測(cè)試色譜圖,以備將來(lái)參考。

A.色譜柱安裝

注:下述步驟給出的流速適用于典型的4.6 mm內(nèi)徑色譜柱。可根據(jù)所安裝Spherisorb色譜柱的柱內(nèi)徑、柱長(zhǎng)、粒徑和柱壓相應(yīng)地提高或降低流速。色譜柱內(nèi)徑和/或柱長(zhǎng)改變時(shí),請(qǐng)參閱“放大/縮小等度分離方法”部分計(jì)算流速。有關(guān)連接HPLC的詳細(xì)信息,請(qǐng)參閱“將色譜柱連接到HPLC系統(tǒng)”。

1、反相色譜柱

1)灌注泵系統(tǒng),排出含緩沖液的流動(dòng)相,然后將色譜柱的入口端連接至進(jìn)樣器出口。

2)用100%有機(jī)流動(dòng)相(甲醇或乙腈)沖洗色譜柱,泵流速設(shè)置為0.1 mL/min,并在5 min內(nèi)增加至1 mL/min

3)當(dāng)流動(dòng)相可從色譜柱出口自由流出時(shí),停止液流并將色譜柱出口連接至檢測(cè)器。這能防止空氣進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng),使系統(tǒng)更快達(dá)到基線(xiàn)平衡。

4)按照步驟2所述逐漸增加流速。

5)一旦柱壓和基線(xiàn)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),即可繼續(xù)進(jìn)行下一部分操作。

2、正相色譜柱

注:以下操作假定您的系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)反相色譜分析。如果并非如此,您可以從第3步開(kāi)始。

1)灌注泵系統(tǒng),排出任何含有緩沖液的流動(dòng)相。

2)用乙腈徹底沖洗系統(tǒng)。

3)將系統(tǒng)的流動(dòng)相換成您計(jì)劃在正相色譜中使用的流動(dòng)相。

4)連接色譜柱并用流動(dòng)相平衡色譜柱。

注:用流動(dòng)相平衡色譜柱時(shí)消耗的溶劑量可能比反相色譜更多。

B.色譜柱平衡

Spherisorb色譜柱是在測(cè)試用流動(dòng)相中保存的。在更換為其他流動(dòng)相體系之前,務(wù)必確保流動(dòng)相的兼容性。請(qǐng)用至少10倍柱體積的流動(dòng)相平衡色譜柱(請(qǐng)參閱表2中的空色譜柱體積)

1、反相色譜柱

 為了避免流動(dòng)相緩沖液在色譜柱或系統(tǒng)中發(fā)生沉淀,請(qǐng)使用5倍柱體積的水/有機(jī)溶劑混合物沖洗色譜柱,其中有機(jī)溶劑比例應(yīng)與所需緩沖鹽流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑比例相同或更低。(例如,使用60%甲醇水溶液沖洗色譜柱和HPLC系統(tǒng),然后再引入60%甲醇/40%緩沖液組成的流動(dòng)相)

 注:如果流動(dòng)相中的添加劑濃度較低(例如離子對(duì)試劑),那么完成平衡可能需要100-200倍柱體積的流動(dòng)相。

2、正相色譜柱

 (Spherisorb硅膠色譜柱、氨基柱、氰基柱)

 Spherisorb正相(NP)色譜柱出廠(chǎng)時(shí)用96%庚烷/4%異丙醇保存。請(qǐng)謹(jǐn)慎操作,避免讓任何可能導(dǎo)致沉淀的流動(dòng)相通過(guò)色譜柱(見(jiàn)上文)Spherisorb正相(NP)色譜柱與水和所有常用的有機(jī)溶劑兼容,前提是考慮溶劑的混溶性。

 用流動(dòng)相平衡正相硅膠色譜柱。即使流動(dòng)相中只含非常少量的水,也會(huì)顯著影響正相填料的活性。為獲得良好的重現(xiàn)性,請(qǐng)確保流動(dòng)相的水含量始終相同。

 流動(dòng)相中的水很難徹底去除,且通常也沒(méi)必要這樣做。使用無(wú)水流動(dòng)相可能要花很長(zhǎng)時(shí)間才能使色譜柱達(dá)到平衡。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用,推薦采用的含水量為飽和值的50%

要平衡色譜柱:

1)從0.0 mL/min開(kāi)始,以0.1 mL/min的增量使流速增加到1.0mL/min

2)用流動(dòng)相平衡色譜柱,直至基線(xiàn)穩(wěn)定。

3)比較2-3次連續(xù)的重復(fù)進(jìn)樣,驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積是否穩(wěn)定。

 使用新色譜柱運(yùn)行首次分析之前,請(qǐng)先執(zhí)行柱效測(cè)試以確認(rèn)色譜柱的性能。

Spherisorb色譜柱的安裝、平衡和初始柱效測(cè)試

C.初始柱效測(cè)定

1. 使用色譜柱之前,需要先進(jìn)行一次柱效測(cè)試。沃特世建議您在收到色譜柱后使用“性能測(cè)試色譜圖”中所述的溶質(zhì)混合物對(duì)色譜柱進(jìn)行測(cè)試。但是,如果色譜柱只用于單次常規(guī)等度分析,那么在等度條件下測(cè)試色譜柱可能更方便。請(qǐng)記錄初始色譜柱性能。

2. 測(cè)定理論塔板數(shù)(N),并定期對(duì)比該數(shù)值。

3. 按預(yù)定的時(shí)間間隔進(jìn)行重復(fù)測(cè)試,跟蹤色譜柱性能隨時(shí)間的變化情況。采用兩套不同的HPLC系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試時(shí),所得柱效結(jié)果可能會(huì)有微小差異,這可能是由于連接質(zhì)量、運(yùn)行環(huán)境、系統(tǒng)電子設(shè)備、試劑質(zhì)量、色譜柱條件和操作員技術(shù)等因素所致。



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