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丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒
注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
貨號: BC0380
規格: 50T/48S
產品內容：
試劑一：液體60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體1mL×1 支，-20℃避光保存；
試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，4℃保存；
試劑七：粉劑×1 支，4℃保存；
工作液的配制：臨用前把試劑四、五、六、七轉移到試劑三中混合溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周。
產品說明：
PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環連接起來。PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導致605nm光吸收的減少。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本的處理
稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入1mL 試劑一和 10μL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、分光光度計預熱 30min以上，調節波長 605nm，蒸餾水調零。
2、每個樣本需要900μL工作液，按樣本數加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）中孵育5min。
3、空白管：在1mL比色皿中加入900 µL工作液和50µL水，混勻，立即記錄605nm處初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，計算 ΔA空白=A1-A2。
4、測定管：在1mL 比色皿中加入900 µL工作液和50µL樣本，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，計算ΔA測定=A3-A4。
三、PDH 活性計算
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性（U /mg prot）=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T
=904.762×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH活性(U/g鮮重)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=913.81×(ΔA測定-ΔA空白)÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。
PDH 活性(U/104 cell)=[(ΔA測定-ΔA空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.828×(ΔA測定-ΔA空白)
V 反總：反應體系總體積，9.5×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。
注意事項：
1、測定過程中所有樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、測定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進行稀釋。
丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測試劑盒
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