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大青葉（Isatidis folium）是我國傳統(tǒng)中藥，為十字花科植物菘藍的干燥葉，具有清熱解毒、涼血消斑的功效，廣泛應用于病毒性流行感冒、流行性腮腺炎等感染性疾病。

標準修訂概況

2024年6月，國家藥典委發(fā)布修訂公示稿，主要修訂點如下：

1、 藥材修訂了薄層鑒別項目，在靛玉紅、靛藍鑒別基礎上，增加對照藥材鑒別項目

2、 增加了雜質(zhì)檢查項目

3、 藥材修訂了含量測定項目，在靛玉紅項目基礎上，增加靛藍含量測定項目，建立兩個化合物同時測定方法，優(yōu)化供試品溶液制備流程

4、 同時修訂飲片標準，包含雜質(zhì)和含量測定

為全面了解標準修訂情況，島津技術(shù)團隊與起草單位河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院做了詳細了解，供中藥行業(yè)相關(guān)單位參考。

標準修訂背景

• 現(xiàn)行版藥典大青葉標準及中成藥標準概況

靛藍、靛玉紅是目前大青葉及其制劑關(guān)注度較高的質(zhì)控指標，目前藥典藥材含量測定僅收載靛玉紅項目測定方法。藥典共收載27 個含大青葉的中成藥，19個靛藍或靛玉紅的薄層鑒別項，均未設置大青葉含量測定項。

• 現(xiàn)行版藥典大青葉標準含量測定方法及標準修訂難點

靛玉紅采用三氯甲烷索氏提取、高效液相色譜法測定。但靛藍在三氯甲烷中解度差，且對光和熱存在一定程度的不穩(wěn)定性，若仍采用原方法，將造成提取不完全或分解、對照品難以配制等問題，影響含量測定準確性。

• 標準立項目的

優(yōu)化《中國藥典》大青葉質(zhì)量標準含量測定的指標及方法，解決大青葉原標準含量測定指標成分單一、方法繁瑣等問題，提高大青葉供試品溶液中靛藍、靛玉紅的提取率及穩(wěn)定性，優(yōu)化大青葉藥材及飲片的質(zhì)量控制方法，同時為大青葉中成藥含量測定方法的建立提供技術(shù)支撐。

標準修訂主要工作簡介

• 起草使用儀器和色譜柱

• 方法優(yōu)化-方法初選

提取溶劑的選擇：根據(jù)靛藍、靛玉紅溶解性及實際實驗效果，在三氯甲烷、甲醇、DMF等多種溶劑中進行考察，最終顯示DMF對二者均有良好的溶解性，但供試品溶液在測定過程中呈現(xiàn)較差的穩(wěn)定性。針對靛藍、靛玉紅在中性、堿性溶液中不穩(wěn)定的性質(zhì)，最終確定使用含磷酸的DMF 溶液作為提取溶劑，結(jié)果顯示溶解度、穩(wěn)定性均良好。

提取方式的選擇：當用加熱回流的?式進行提取時，靛藍已檢測不到；當用 100℃熱浸時，靛藍含量也有不同程度的減少；當用超聲提取時，靛藍亦有分解。最終確定采用振搖提取，該法提取率高且穩(wěn)定性好。

• 提取條件的單因素考察

磷酸體積分數(shù)：各因素對含量的影響作性原則 ，權(quán)衡高效和普適，為避免高濃度磷酸溶液的低pH 值對色譜系統(tǒng)的影響，以近平緩的5% 磷酸體積分數(shù)為理想試驗區(qū)域。

振搖時間：靛藍、靛玉紅具有不同程度的光不穩(wěn)定性，為避免影響實驗結(jié)果，并考慮到方法的經(jīng)濟性，以40 min振搖時間為理想試驗區(qū)域。

料液比：兩個成分含量隨液料比的變化趨勢一致，在（20∶1）～（80∶1） mL·g–1范圍內(nèi)，含量呈上升趨勢，在50∶1 mL·g–1時趨于平緩。

• Box-Behnken 響應面法優(yōu)化提取方法

各因素交互作用對含量影響的響應面圖和等高線圖

通過軟件優(yōu)化得到實驗條件下的最佳工藝條件及預測的結(jié)果，即最佳提取大青葉中靛藍、靛玉紅的方法為：磷酸體積分數(shù)5. 345%，振搖時間40 min，液料比50∶1 mL·g–1，靛藍、靛玉紅含量預測值分別為746. 659、392. 032 μg·g–1。實際操作確定方法為磷酸體積分數(shù)5%，振搖時間40 min，液料比50∶1 mL·g–1，進行驗證試驗，得到靛藍、靛玉紅含量平均值為735. 517、399. 123 μg·g–1，與預測值的RSD 為0. 8%、0. 9%，驗證建立的回歸模型可靠，優(yōu)化的方法實際可行。

• 方法學考察典型圖譜

混合對照、樣品?譜圖  峰 1 靛藍 峰 2 靛?紅

• 樣品測定與限度制定

取藥材 15 批和飲? 20 批，按正??法測定。收集到的樣品中靛藍和靛?紅總量在 0.056%~0.435%之間，最低值為 0.056% ，平均值為 0.165%，對比了不同批次藥材及飲?的性狀，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異或不符合性狀描述的批次。故暫0.050%作為??葉中靛藍與靛?紅總量的限度值。

• 標準修訂工作相關(guān)成果

與大青葉現(xiàn)行質(zhì)量標準藥典采用三氯甲烷索氏提取測定靛玉紅含量的方法相比，優(yōu)化方法科學選擇了提取溶劑為含磷酸的DMF 溶液，振搖提取的方式，明確了高效、經(jīng)濟、穩(wěn)定測定大青葉中靛藍的新方法，可同時測定靛藍與靛玉紅含量，操作簡便，結(jié)果準確。

河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院在《中國醫(yī)院藥學雜志》2024 年 3 月第 44 卷第 5 期刊登“響應面法優(yōu)化《中國藥典》大青葉含量測定方法及差異分析”文章。

河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院在2023年10月獲得國家知識產(chǎn)權(quán)局頒發(fā)發(fā)明專利證書“一種同時測定大青葉中靛玉紅與靛藍含量的方法”，專利號：ZL 2021 1 10122499.4。

參考文獻：[1]王曉蕾,孫慧珠,劉曉明,等.響應面法優(yōu)化《中國藥典》大青葉含量測定方法及差異分析[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2024,44(05):557-563.DOI:10.13286/j.1001-5213.2024.05.11.

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