基因功能研究一直是科學研究的核心內容，科學家們往往先發現表型，再去研究機制，那么如何從表型出發發現相關的基因呢？高通量基因篩選應運而生。在基因篩選實驗中，RNA干擾（RNAi）仍然是有效的篩選方法。通過合成小干擾 RNA（siRNA）進行RNA干擾更是基因篩選研究的。

今天小編帶大家快速學習一篇Nature paper，看看siRNA基因沉默篩選如何開展，及最終如何發現病毒自噬新機制。

背景

細胞使用自噬來降價不需要的物質。自噬過程首先將不需要的物質隔離在自噬小體（autophagosome）中，然后自噬小體與溶酶體融合，將里面的物質降解為構成單元（building block），比如氨基酸，并將它們回收用于其他用途。

自噬物質包括舊的或有缺陷的細胞器和蛋白、細菌和病毒入侵者。科學家們已經基本確定了細胞啟動和調節自噬的途徑。然而，迄今為止還不清楚，是否有一條途徑專門針對病毒進行自噬。

研究過程

1.

為了尋找針對病毒的自噬途徑，首先開展了全基因組siRNA基因沉默篩選：

初篩基于自噬小體的點狀表型（GFP-LC3標記）：使用兩種病毒SIN或HSV-1ΔBBD感染 HeLa/GFP-LC3細胞后，細胞會產生GFP-LC3自噬小體點。作者分別用這兩個感染體系來進行篩選，使用了Dharmacon siGENOME siRNA全基因組文庫，通過成像檢測LC3點的數量，選擇那些沉默后導致病毒誘導自噬小體點減少的基因，且排除了那些有明顯細胞毒性（細胞生長異常）或者影響生理性自噬的基因，初篩共獲得了310個潛在陽性基因；

驗證性篩選（去卷積篩選）基本重復了這一過程，使用了Dharmacon Cherry-pick siGENOME library siRNA set of 4，僅有>=2條siRNA能重復出表型的基因被篩選出來，共篩選出來216個陽性基因，其中兩種病毒感染體系的交集有154個基因；

展開生物信息學分析，確定了分子功能相關的陽性基因集，再考慮到大多數病毒通過細胞內吞作用侵入細胞，最終選定SNX5（sorting nexin 5）作為進一步研究的對象。SNX5是一種細胞內吞體蛋白，包含兩段重要的結構域：一段可與磷酸肌醇（如 PtdIns(3)P）結合的PX結構域；一段感知、驅動膜結構彎曲的BAR結構域。

2.

在其他病毒中進一步驗證SNX5的效果：

細胞和小鼠的病毒感染實驗表明，siRNA沉默后SNX5后抑制了寨卡病毒（Zika virus）、西尼羅河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒(CHIKV) 八種來自五個差異巨大的病毒科的人類病毒的感染后自噬；

3.

免疫共沉淀實驗分析SNX5的相互作用蛋白：

SNX5與PI3KC3-C1發生相互作用進而激活細胞自噬，兩者間相互作用無需PI3KC3-C1脂質激酶激活，提示SNX5作用于PtdIns(3)P上游；

4.

細胞定位實驗分析SNX5蛋白功能：

熒光標記病毒侵染細胞后發現SNX5選擇性募集到毒顆粒的內吞體表面，而BAR突變型SNX5不會出現募集。BAR結構域內帶正電基團可通過靜電作用介導帶BAR結構域的蛋白與雙層脂質結構相互作用，提示SNX5通過BAR結構域提高膜的曲率來活化自噬相關的PI3KC3-C1激酶復合體，從而激活自噬。

5.

驗證SNX5自噬通路是否是病毒誘導特異性的：

siRNA沉默囊泡轉運復合體基因VPS29并檢測葡萄糖轉運蛋白-1（GLUT-1）逆向轉運功能，VPS29敲減后囊泡轉運復合體功能發生障礙但病毒誘導自噬未受影響。另一方面，SNX5KO HeLa細胞轉鐵蛋白受體回收循環動力學和表皮生長因子降解效率均未受影響，提示SNX5敲除不影響早期及晚期細胞內吞活動。

討論

這些結果共同表明，細胞確實有一條的病毒自噬途徑，該途徑是由SNX5控制的。這一新發現細胞生物學、病毒學和自噬學中一個重要基礎知識的空白，并為基于自噬調控的廣譜抗病毒治療策略和藥物的研發提供了重要的基礎。

這篇研究全篇使用了Dharmacon的siRNA文庫，Dharmacon siRNA產品有如下特點：

SMARTselectionTM技術?高度特異性，確保沉默效率
我們使用SMARTselection™ 技術設計高質量siRNA，該技術涵蓋一整套完整而嚴密的設計算法，針對每個基因投放的4條siRNA至最終的產品中。

SMARTpoolTM技術?無需驗證，保證至少75％靶基因沉默效率
我們通過SMARTpoolTM技術更好的模擬內源RNAi通路，將針對同一靶基因的4條siRNA混合成為一管試劑，保證更高效的基因沉默效率。同時，由于每條siRNA的濃度相對降低而減少了脫靶效應（off-target），增強實驗數據的真實性。

雙鏈修飾技術，有效減少off-target并進一步提升沉默效率
siRNA是雙鏈結構，最主要的脫靶效應是由反義鏈中“seed region”活性引起的，此外，正義鏈也有可能引起脫靶。我們擁有的雙鏈修飾技術，對正義鏈和反義鏈同時進行修飾，能夠有效的減少脫靶效應90%以上，同時抑制miRNA-like作用，并能有效減少細胞的生長抑制，保證沉默效率的同時防止假陽性。

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