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高效液相色譜法測定食品中的色氨酸

來源:安徽皖儀科技股份有限公司   2024年06月24日 15:40  

解乏、補充營養(yǎng)、改善睡眠......對它的檢測很關(guān)鍵!



前言

 

色氨酸(Tryptophan),又稱β-吲哚基丙氨酸,是一種有機化合物,化學(xué)式C11H11N2O2,是人體的必需氨基酸之一。色氨酸是植物體內(nèi)生長素生物合成重要的前體物質(zhì),其結(jié)構(gòu)與IAA相似,在高等植物中普遍存在,也是人體中重要的神經(jīng)遞質(zhì)—5-羥色胺的前體,可用于妊娠期婦女營養(yǎng)補充劑和乳幼兒的特殊奶粉,用于煙酸缺乏癥,作為安神藥,可調(diào)節(jié)精神節(jié)律,改善睡眠,也是復(fù)方氨基酸大輸液的原料之一。

 

關(guān)鍵詞:液相色譜;熒光檢測器;食品;L-色氨酸;內(nèi)標(biāo)法。

 

1.實驗方法


1.1
儀器配置


 

表1高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

1.png


 

1.2 測試條件

色譜柱:Nova Atom PC18, 4.6×150mm,3μm;

柱溫:35℃;

流速:0.8ml/min;

流動相:A/B=甲醇/0.01mol/L乙酸銨;

進樣量:10μL;

 

表2 流動相梯度洗脫表

2.png


 

1.3 試劑及實驗材料

甲醇:色譜純,

乙酸:色譜純,

乙酸銨:色譜純,

無水氫氧化鋰:電子級;

鹽酸:優(yōu)級純;

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):L-色氨酸(CAS號:73-22-3);

內(nèi)標(biāo)物:1-甲基-D-色氨酸(CAS號:110117-83-4);分析天平;

超聲脫氣裝置;

濾膜:0.45μm,0.22μm。

 

1.4 標(biāo)樣制備

1.4.1 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.00mg/mL)

準(zhǔn)確稱取25mg(精確至0.0001g)L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,于25mL容量瓶中,用超純水溶解并定容至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。轉(zhuǎn)移至棕色玻璃容器中,于4℃冰箱中保存。保存期6個月。

 

1.4.2 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(100μg/mL)

吸取L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液 1.00mL 于 10mL 容量瓶中,用水定容至刻度,混勻。轉(zhuǎn)移至棕色玻璃容器中,于4℃冰箱中保存,保存期6個月。

 

1.4.3 內(nèi)標(biāo)工作液(1 mg/mL)

稱取 10 mg(精確至 0.001g)1-甲基-D-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL,容量瓶中,用水溶解后定容至刻度,混勻。轉(zhuǎn)移至棕色玻璃容器中,于4 ℃冰箱中保存,保存期6個月。

 

1.4.4 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液

分別移取L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)中間液 2.0μL、10μL、50μ L、100μL、200μL、500μL于1mL容量瓶中,各加入 100μL內(nèi)標(biāo)工作液,加水定容至刻度,混勻。L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的質(zhì)量濃度分別為0.20μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL。臨用現(xiàn)配。

 

2 結(jié)果與討論

 

2.1 單標(biāo)定性

取L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液10.0μg/mL和內(nèi)標(biāo)使用液100 μg/mL按照1.2測試條件分別進樣,記錄進樣時間和譜圖(圖1-2)。

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圖1  L-色氨酸(10.0μg/mL)單標(biāo)譜圖


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圖2 內(nèi)標(biāo)(100μg/mL)單標(biāo)譜圖


單標(biāo)譜圖數(shù)據(jù) 

5.png

說明:由圖可知目標(biāo)峰附近無雜質(zhì)干擾。理論塔板數(shù)為9577,符合實驗要求。

 

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的質(zhì)量濃度分別為0.20μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL,按照1.2的測試條件進樣分析,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),采用內(nèi)標(biāo)法建立工作曲線。結(jié)果如圖3所示。

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圖3  L-色氨酸校準(zhǔn)曲線線性圖

 

說明:由數(shù)據(jù)可得,L-色氨酸在0.2-50.0μg/mL濃度范圍內(nèi)曲線方程為y=0.75435*x+0.00231,R平方值≥0.9999,具有良好線性符合實驗要求。

 

2.3 重復(fù)性試驗

取濃度10.0μg/mL 的L-色氨酸,內(nèi)標(biāo)濃度100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照1.2的測試條件分別連續(xù)進樣測定7次,重復(fù)性色譜圖如圖5所示。

7.png

圖4  L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(10.0μg/mL )重復(fù)性疊加譜圖(n=7)


譜圖數(shù)據(jù)

8.png

說明:由數(shù)據(jù)可得,濃度(10.0μg/mL)的L-色氨酸和濃度100μg/mL的1-甲基-D-色氨酸保留時間重復(fù)性小于0.15%,峰面積重復(fù)性小于0.55%,測試重復(fù)性良好,說明皖儀LC3200系列高效液相色譜儀具有良好的精密度。

 

2.4 檢出限實驗

取濃度0.20μg/mL 的L-色氨酸,內(nèi)標(biāo)濃度100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照1.2的測試條件進樣測定,記錄譜圖如圖4。

9.png

圖5  0.20μg/mL 的L-色氨酸譜圖

 

10.png

說明:由數(shù)據(jù)可得,L-色氨酸的儀器檢出限為0.002μg/mL,定量限為0.007 μg/mL。符合實驗要求。


2.5 樣品實驗

準(zhǔn)確稱取試樣 0.2 g(精確到 0.001g)于 10ml,螺紋帶蓋的聚四氟乙烯水解管中,依次加人 0.5 ml 內(nèi)標(biāo)品溶液、5.0ml氫氧化鋰溶液,渦旋混勻后超聲溶解,于 110 ℃恒溫箱中水解 20h。取出水解管,冷卻至室溫,用3mol/L鹽酸調(diào)pH至6-8,用水將樣品轉(zhuǎn)移并定容至 50mL,容量瓶中,混勻,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,濾液供液相色譜測定。


空白樣品譜圖如圖6,樣品譜圖如圖711.png

圖6 某奶粉空白樣品譜圖


12.png 

圖7 樣品譜圖


譜圖數(shù)據(jù)

13.png


說明:由數(shù)據(jù)以及標(biāo)準(zhǔn)中的公式計算,樣品含量為2650mg/100g。

 

2.6 注意事項

1.配制流動相0.01mol/L乙酸銨時需先調(diào)節(jié)pH,再定容。

2.內(nèi)標(biāo)物質(zhì)用水溶解較慢,可用超聲加速溶解。

 

 

3 結(jié)論

本文使用皖儀LC3200系列高效液相色譜儀對標(biāo)準(zhǔn)品L-色氨酸進行了檢測,實驗結(jié)果表明L-色氨酸在濃度在0.2-50.0μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)大于0.9999L-色氨酸連續(xù)進樣7次的保留時間重復(fù)性小于0.2%,峰面積重復(fù)性小于0.6%,測試重復(fù)性良好。儀器檢出限為0.002μg/mL,定量限為0.007μg/mL。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高,可用于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品和嬰幼兒谷類輔助食品中色氨酸的測定。

 




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