細胞凍存是指將細胞放在低溫環境，以達到減少細胞代謝的作用，從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的，以供后續實驗或臨床使用。細胞凍存一般采用慢凍原則，慢凍可使細胞逐步脫水，細胞不會因為產生大的冰晶而收到損害。

一、原理

當溫度低至-70℃時，細胞內的代謝活動及酶活性幾乎全部停止，低于-130℃時，細胞能達到最佳存活率。液氮可實現細胞的長期保存。

冷凍保護劑二甲基亞砜（DMSO）能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。

二、貼壁細胞凍存操作步驟

1、預熱凍存液；

2、用PBS沖洗細胞，加入胰酶消化（此步驟同細胞傳代操作）；

3、終止消化后，重懸細胞，轉移至無菌EP管，1000rpm離心5min；

4、棄上清，加入預熱的細胞凍存液，細胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；

5、分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；

6、將分裝好的凍存管轉入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

7、將凍存管轉移至液氮長期保存。

三、懸浮細胞凍存操作步驟

1、用移液管將細胞懸液吹吸均勻，將細胞懸液移入離心管；

2、1000rpm離心 3 min，收集細胞沉淀；

3、用預熱的凍存液重懸細胞，細胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；

4、分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；

5、將分裝好的凍存管轉入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

6、將凍存管轉移至液氮長期保存。

貼壁細胞凍存操作示意圖

注意事項：

①　細胞培養、傳代以及凍存需要嚴格的無菌操作。

②　傳代時需要適度的消化，消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

③　傳代應在細胞處于對數期、未達到匯合狀態時進行。

④　細胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中。

⑤　應選擇匯合度80%-90%左右，并且活力達90%以上處于對數生長期時的細胞進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態最佳，凍存密度可根據細胞特性進行調整。

⑥　程序凍存盒、細胞凍存液、全培養基等試劑都要復溫至室溫備用。

⑦　凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉速過大或離心時間過長，以免造成細胞損傷。

⑧　凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。

⑨　細胞不可長期保存在-80℃冰箱中，放置時間不要超過3天。

⑩　液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。