一， 酶功能及適用范圍介紹

細(xì)胞作為生物的基本結(jié)構(gòu)單元（病毒除外），在生命活動(dòng)過(guò)程中扮演著重要角色，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域經(jīng)常被用于基因和藥物研究的工具。實(shí)驗(yàn)使用到的細(xì)胞主要是細(xì)胞系（Cell line）和原代細(xì)胞（Primary cells），這兩種細(xì)胞各有優(yōu)缺點(diǎn)，例如原代細(xì)胞能夠很好地模擬生物體內(nèi)的環(huán)境但是重復(fù)性差；細(xì)胞系雖然重復(fù)性好，但是不能很好地模擬生物體內(nèi)的環(huán)境。因此，很多時(shí)候在實(shí)驗(yàn)會(huì)需要進(jìn)行原代細(xì)胞的分離，對(duì)于原代細(xì)胞的分離主要是酶消化法，參與消化的酶因組織差異而存在不同，下邊就介紹一下實(shí)驗(yàn)室常用的用于分離原代細(xì)胞的酶。

（圖1 原代細(xì)胞與細(xì)胞系的比較）

胰蛋白酶（Tyrisin）是目前各細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用廣泛的細(xì)胞/組織消化試劑，工作濃度在0.25%胰酶（外加0.02%EDTA（0.53mM）），它適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織原代細(xì)胞的分離以及實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞傳代。它的作用機(jī)制是作用于精氨酸或賴氨酸相連接的肽腱，消除細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使組織分散成單個(gè)細(xì)胞而分離獲得原代細(xì)胞（Primary cells）。

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA）是，一種金屬螯合劑，用于螯合培養(yǎng)基或平衡液中的二價(jià)離子，有助于增強(qiáng)胰蛋白酶的水解功能；此外血清能夠降低胰酶活性，因此在終止消化的時(shí)候可以添加至少5%的血清去終止胰酶的消化。

二， 胰蛋白酶配制

胰蛋白酶（Tyrisin）是為一種蛋白酶，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和原代細(xì)胞分離過(guò)程很常見(jiàn)，尤其是細(xì)胞傳代或凍存消化過(guò)程最常見(jiàn)的酶，在此以0.25%胰酶配制舉例：

（1）稱取胰酶：電子天平稱取0.25g胰蛋白酶（Tyrisin），然后溶于100ml 無(wú)菌PBS；（2）低溫低速攪拌：在胰蛋白酶加入到PBS中后，需要低溫長(zhǎng)時(shí)間攪拌（4℃/冰浴，過(guò)夜-12-16h）；（3）調(diào)節(jié)pH:胰酶的最佳消化pH在7.4左右，因此需要調(diào)整pH；（4）過(guò)濾分裝：一般使用0.22μm濾器進(jìn)行過(guò)濾，這樣幾乎就消除了細(xì)菌，可以多過(guò)濾1-2次，尤其在大批量制備時(shí)候；（5）分裝保存：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的使用情況進(jìn)行分裝，然后凍存在-20℃，正在使用的少量胰蛋白消化液于4℃保存即可；

（備注：低速配制，高速會(huì)導(dǎo)致胰蛋白酶氣泡進(jìn)而酶的效力大大折扣，如果要加強(qiáng)消化能力，可以添加終濃度為0.02% EDTA（0.53mM）主要是消除PBS中Ca2+的影響，增強(qiáng)酶活性。）

三，原代細(xì)胞的分離（以小鼠腎臟為例）

對(duì)于原代細(xì)胞的分離成功與否最關(guān)鍵因素有三：（1）全程無(wú)菌操作；（2）選擇合適的酶和濃度；（3）選擇合適的消化時(shí)間?，F(xiàn)在以小鼠腎臟為例，進(jìn)行原代細(xì)胞分離的剖析：

（a）準(zhǔn)備工作

對(duì)于原代細(xì)胞分離培養(yǎng)通用的準(zhǔn)備工作主要涉及培養(yǎng)基（普通培養(yǎng)基，可以適當(dāng)添加細(xì)胞因子Egf和/或bFGF）、無(wú)菌操作環(huán)境（紫外燈15-30 min）、實(shí)驗(yàn)器材高壓滅菌、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

（圖2 小鼠腎臟原代細(xì)胞分離示意圖）

（b）細(xì)胞分離步驟

（1）小鼠安樂(lè)/犧牲：大家要慢慢養(yǎng)成尊重動(dòng)物福利的習(xí)慣，不然后期各方面不好說(shuō)，尤其是面向世界各地研究員；

（2）暴露小鼠腹腔：使用鑷子夾住小鼠（3周左右）腹部表面皮膚，在腹部中間橫向開(kāi)口約0.5cm，然后讓皮膚直接往上扯（有點(diǎn)殘忍，但是顯著性減少細(xì)菌感染）；當(dāng)然有可以把腹部皮膚逐步用鑷子扯開(kāi)，然后露出完整腹膜（千萬(wàn)別弄破）；

（3）取出腎臟器官：使用無(wú)菌剪刀將腹膜縱向剪開(kāi)，然后在小鼠腰部找到腎臟組織，使用鑷子將其取出；

（4）組織殺菌：將腎臟組織轉(zhuǎn)移至約10mlPBS（含3x or 2x 青霉素-鏈霉素）中反復(fù)顛倒消毒3-5 min；

（5）組織破碎：根據(jù)組織塊的大小（一般建議不超過(guò)1cm3）,轉(zhuǎn)移直尖底1.5ml EP管中，加入適量消化液（總體積不超ep管2/3），然后使用眼科鉗充分剪碎組織；

（6）胰酶消化：使用終濃度為1-2 mg/ml膠原酶 Ⅰ在37℃震蕩水浴搖床消化20-30min，可以在消化10min、15min、20min、25min、30min取出少量消化液查看消化液中單個(gè)細(xì)胞的情況（是否存在皺縮/組織塊），進(jìn)而確定最佳消化時(shí)間。

（7）過(guò)濾：體細(xì)胞直徑一般在10-20μm之間，但組織原代酶消化時(shí)候，不能用稍大一些的濾器，而是要大得多的濾器（能過(guò)濾掉組織就行），一般選擇200-400目（數(shù)值越大，濾網(wǎng)直接越?。?；

（8）離心收集細(xì)胞：在1000rpm左右離心5min獲得的過(guò)濾細(xì)胞懸液，并使用4℃預(yù)冷的培養(yǎng)基/PBS洗滌細(xì)胞3-5次；

（9）細(xì)胞種植：根據(jù)細(xì)胞計(jì)算，按照不同尺寸的細(xì)胞培養(yǎng)皿種植細(xì)胞，一般在培養(yǎng)皿的80-90%融合率即可，因此此時(shí)剛分離非細(xì)胞，可能細(xì)胞的分離有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但是濃度太高則會(huì)因?yàn)榉蛛x過(guò)程存在死亡細(xì)胞，會(huì)釋放大量的損傷相關(guān)分子模式（DAMP）損傷正常細(xì)胞；

（10）細(xì)胞觀察與換液：一般在種植24h左右換液并觀察細(xì)胞，在36-48h根據(jù)細(xì)胞的密度和細(xì)胞狀態(tài)兩個(gè)因素，確定繼續(xù)培養(yǎng)還是傳代或者后續(xù)實(shí)驗(yàn)。