G蛋白偶聯受體（GPCR）參與許多細胞信號轉導通路。目前，超過45%的藥物都以GPCR為靶點。確定GPCR細胞活性，可以通過監測細胞內Ca2+濃度的變化來實現。Ca2+直接或間接調節包括基因表達、細胞運動和收縮在內的許多生理過程。諸如蛋白激酶C（PKC）、轉錄因子NFAT或鈣調磷酸酶等多種蛋白質均受Ca2+濃度變化的調節。在此，我們介紹了使用VICTOR™ Nivo多模式讀板儀以水母發光蛋白生物發光檢測方法，分析在GPCR刺激或抑制下的快速胞內Ca2+信號。

化學發光法檢測原理是基于GPCR的激活引起細胞質Ca2+濃度增加：當GPCR被激動劑激活后，Gαq亞基從G蛋白解離并誘導肌醇三磷酸濃度增加；從而引起鈣從內質網流入。該檢測采用穩定表達人組胺H1 GPCR和水母發光蛋白的CHO細胞系進行。已知的激動劑和拮抗劑用于受體刺激。檢測中，細胞與腔腸素-h一起孵育。腔腸素-h穿透細胞膜并在氧氣存在下與高表達的水母發光蛋白結合，導致后者重組。在三個Ca2+離子的作用下，水母發光蛋白分子將腔腸素-h底物氧化為腔腸酰胺，釋放二氧化碳并在469nm處產生具有峰值的閃光，通過VICTOR Nivo檢測。

由于GPCR激活后細胞內Ca2+濃度增加且相應的閃光產生速度非常快，因此該檢測需要極快速的測量響應。VICTOR Nivo讀板儀的分液器可以滿足這一需求，它可以在進樣后0.1秒從微孔板底部檢測發光信號。

結果與討論

陽性化合物Digitonin量效關系

VICTOR Nivo系統的動力學檢測模式在添加陽性對照Digitonin后精確測量隨時間變化的發光信號（圖2）。結果表明，Digitonin濃度越低，產生光信號延遲越長，而最高濃度的Digitonin能最快產生光信號。這顯示了化合物濃度對Ca2+和信號產生所需時間的影響VICTOR Nivo對發光信號曲線的快速動力學測量提高了在不同化合物濃度下化合物效應檢測的準確性，因此能夠精確計算劑量反應曲線。對Digitonin動力學測量中產生的信號進行整合，并計算曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應曲線。這證實Digitonin能作為水母發光蛋白檢測中的對照品。

細胞數滴定

為了確定H1/水母發光蛋白細胞的檢測窗口，進行了細胞數滴定。不同數量的細胞產生的發光信號正相關不同的Ca2+濃度。Histamine作為H1受體的標準激動劑。結果表明，當細胞數約80000-100000個/孔時，發光信號達到飽和。此外，在不同細胞密度下，光信號的峰值都是同時產生的。因此，以20000個細胞/孔進行后續實驗。

在每孔不同數量的細胞中加入組胺（1.56μM）產生的發光信號。

使用組胺優化激動劑信號檢測

使用優化的細胞數，在H1受體受到組胺刺激后記錄激動劑檢測的動力學測量結果。

使用20000個細胞/孔，在H1受體受到組胺刺激后產生的Ca2+信號反應的動力學。

與Digitonin類似，研究表明，組胺濃度越低，產生閃光越滯后，而最高濃度的組胺會立即引發光信號。對H1 GPCR動力學測量中產生的信號進行整合，并繪制曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應曲線。計算得出384孔板實驗條件下組胺的EC50為143.4nM。與先前發表的數據一致。

通過在96孔板格式中重復該實驗，證實了該方法的普適性。108nM組胺的EC50與384孔板實驗中計算的143nM EC50在同一范圍內，表明該方法適用于不同類型的微孔板。

96孔板格式中H1受體刺激后的激動劑檢測。A：在H1受體受到組胺刺激后產生的Ca2+信號反應的動力學。B：組胺激動劑刺激H1受體后的劑量-反應曲線。

抑制劑信號檢測

為了證明H1-水母發光蛋白檢測法也可用于受體抑制劑檢測，在激動劑檢測實驗中測定的EC80濃度下，用Triprolidine（曲普利啶）對組胺進行了拮抗劑檢測。繪制曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應曲線，計算Triprolidine的IC50為12.28nM。

EC80濃度下通過曲普利啶拮抗劑對組胺激動劑進行檢測的H1受體抑制的劑量-反應曲線。

結論

本研究描述了水母發光蛋白快速發光檢測法的優化，以檢測激動劑和拮抗劑對Ca2+偶聯的組胺H1 GPCR的影響。該方法的標準偏差低，板間差異性小，再現性良好。VICTOR Nivo多模式讀板儀與分液器結合非常適用于這類檢測。使用預先設定的方案，利用孔內信號發生動力學測量和板底部快速信號檢測，結合VICTOR Niv的分液器，為該檢測提供了靈活性。

參考文獻

1. J. A. Salon, D. T. Lodowski and K. Palczewski, The significance of G-Protein Coupled Receptor Crystallography for Drug Discovery, ASPET Pharmacological Reviews (2011).

2. Berridge M.J., Lipp P., Bootman M.D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. (2000).

3. Iversen P. W., Eastwood B. J., Saittampalam G. S., Cox K. A Comparison of Assay. Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z′ Factor, and Assay Variability. Ratio. Biomolecular Screening (2006).

4. Oksa V. V., Kivela P., Aequorin Bioluminescence assays on MicroBeta2 LumiJet for studying Ca2+-coupled GPCRs and ion channels. Application Note, PerkinElmer (2009).

5. Technical Data sheet: human Histamine H1 Receptor Aequorin Cell Line, PerkinElmer.