一，基本概念

報告基因：基因表達變化或者與基因表達變化相關的細胞事件的一個指示劑。通常是一種編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因，其表達產物非常容易被鑒定。

熒光素酶（luciferase）：一類能夠產生生物發光信號的酶的統稱，其中最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶。螢光素酶可以催化自身底物氧化，反應中一部分能量以光子形式被釋放，即生物發光信號。螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細胞中不含內源性螢光素酶，一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時在所有的化學發光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。

二，熒光素酶促進生物發光的機制

以螢火蟲螢光素酶的生物發光反應為例（主報告基因）：

螢光素酶是一種作為化學反應催化劑的蛋白質，能在螢光素、ATP和其它細胞離子存在的條件下促進光的產生。化學反應本身包括兩個步驟：

1. 在螢光素酶存在的條件下，螢光素+ATP生成螢光素化腺苷酸+ ADP。

2. 將螢光素化腺苷酸+氧氣轉化為氧化螢光素+AMP以及光。

螢火蟲熒光素酶一般是作為主報告基因，將目的基因構建在該載體上，從而反應目的序列的作用結果，因此根據我們的實驗目的，可以針對此質粒進行改造，載體的工作原理如下圖所示：

海腎熒光素酶催化的發光反應需要腔腸素和O2的參與，發光顏色為藍色。

海腎熒光素酶通常作為內參報告基因，來標定檢測用報告基因的測量結果，從而達到有效地減少實驗誤差的目的，載體的工作原理如右圖所示：

三，實驗方法

1. 用生物信息學方法分析并預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點（若目標是檢測miRNA 及其靶基因的靶向作用，則需要預測兩者結合位點）。
2. 設計引物用 PCR 法從基因組 DNA 中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（如 pGL3-basic）中。

3. 克隆報告基因載體：質粒的提取、轉化。

4. 工具細胞培養和轉染：293T細胞。

細胞培養：生長 90%匯合的細胞進行傳代培養。

細胞鋪板：取對數生長期的細胞制成細胞懸液，計數，接種于 96-well 培養板中。37℃、5% CO2培養箱培養至細胞融合度達到約 60%。

瞬轉24h；給藥24h。（瞬時轉染（Transient Transfection）與雙螢光素酶報告基因檢測；穩定轉染（StableTransfection）與單螢光素酶報告基因檢測）

5. 實驗室用報告基因檢測方法：

1)用1ml注射器棄去96孔板中的培養基

2)取Reporter lysis 5×Buffer 裂解液，稀釋5倍（1.5ml+6ml純水），混勻

3)用排槍+ 100 μl/孔

4)搖床上震蕩30min

5)洗凈白板（全白色不透光平板（White Plates, Solid Bottom）、吹干，排槍吸取50μl/孔加至白板中

6)配底物：1ml+2.5ml純水，注意避光

7)避光用排槍+底物50μl/孔

8)立即用酶標儀檢測（特異生物學反饋+非特異生物學反饋）

• 發光檢測儀（Luminometer），或者帶有發光檢測模塊（使用化學發光，無需設置波長）

6. β-半乳糖苷酶檢測（β-Gal）（內參）

（報告基因A檢測剩下在原96孔板中的用作β-Gal檢測）

1)原96孔板中+ β-Gal檢測試劑50ul/孔

2)蓋上蓋子用保鮮膜封住防止蒸發，輕拍混勻，放于37℃敷箱30min，樣品孔會呈淺黃色

3)+150ul/孔β-半乳糖苷酶反應終止液，混勻

4)分光光度計檢測420nm處波長（非特異生物學反饋）

7. 數據處理：

主報告基因與內參基因的相對活性比值作為相對光強度RLU，再作歸一化處理。

CHASELECTION逐典螢光素酶報告基因檢測試劑盒旨在準確、靈敏、高效地測定螢火蟲螢光素酶活性，應用高通量藥物篩選、藥物活性檢測、大規模啟動子功能測定、信號通路等研究。

逐典螢光素酶報告基因

針對報告基因檢測不同的側重需求，逐典推出了3種檢測系統。

逐典螢光素酶報告基因優勢：

1. 檢測靈敏度高，信號穩定性好

HEK293-NFK B-LUC細胞加入梯度稀釋的TNF 在37C、5%CO條件下刺激6小時后,分別用增強型、超敏型、穩定型檢測試劑進行信號檢測。

2. 操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測緩沖液混合后直接加入到細胞即可。

3. 穩定性好

同時在10次反復凍融實驗中，逐典全系列報告基因檢測試劑盒顯示出較強的穩定性。