引言

基于細胞活性和毒性檢測的實驗在基礎研究中有廣泛的應用，類似的實驗也用于臨床前研究，以表征化合物誘導的細胞毒性和副作用。相對于生物化學的方法，細胞實驗能夠提供更多的生理相關數據，如細胞增殖，形態和信號通路等。

ATPlite 1step 化學發光實驗使用代謝活性細胞中的 ATP 作為細胞活力的標志物。利用細胞凋亡和壞死時 ATP 濃度降低這一方法監測化合物誘導的細胞毒性作用是非常快速和靈敏的方法。

新面市的 VICTOR Nivo™ 多功能酶標儀其整合了光吸收，化學發光，熒光強度，時間分辨熒光以及熒光偏正五種檢測模式。VICTOR Nivo™ 讀板器提供基于微孔板頂部和底部的檢測，底部檢測模式允許蓋板蓋，并在細胞相關的實驗測定中實現更好的靈敏度。

材料和方法

在含有 10％ 胎牛血清 (FCS)，1％ 青霉素(100U / mL) /鏈霉素 (100μg/ mL) 的 Dulbecco's Modified Eagle 培養基 (DMEM) 中培養人肝細胞癌細胞 (HepG2，DSMZ no. ACC180) 2mM 谷氨酰胺。 將中國倉鼠卵巢細胞 (CHO-K1，DSMZ no.ACC 110) 放置在含 10％ FCS 和1％ 青霉素 (100U / mL) /鏈霉素 (100μg/ mL) 的 DMEM / F-12 培養基中培養。

ATPlite 1step 檢測方法：先將細胞潤洗，胰蛋白酶消化后重懸于細胞培養基中并轉移至 384 孔板（每孔 25μl 細胞懸液）或 96 孔板（每孔 100μl 細胞懸液）。（推薦使用 PerkinElmer 白色細胞培養板 CulturPlate-384，＃6007680或 CulturPlate-96，＃6005680）

24h 后，用 DMSO (終濃度為 0.5％v / v) 溶解化合物 (秋水仙堿，5-氟嘌呤，Pac1) 并使用 Echo 液體處理系統 550 (Labcyte，Inc)加樣。在37℃，5％ CO2 條件下孵育 48 小時。將凍干的熒光素酶底物溶于 ATPlite 1step 緩沖液中，并在細胞中加入底物 (25μl/ 384 孔板，96 孔板/100μl )。根據試劑盒說明書，在加入前將 ATPlite 試劑平衡至室溫。最后放入 VICTOR Nivo™ 酶標儀讀數。測試步驟中需要預先將額外的 60s 振蕩步驟添加到發光檢測步驟 (ATPlite Luminescence) 中。最后使用 GraphPad Prism 軟件進行數據分析。

結果

為了展示 VICTOR Nivo™ 酶標儀和 ATPlite 1step 方法對化合物的細胞毒性檢測，我們研究了其方法的穩定性，靈敏度和動態范圍。

圖 1 ATP 的標準曲線滴定檢測該方法的線性和動態范圍。

圖 2 384 孔板中，細胞數目和檢測信號的相關性。

圖 3 96 孔板中，細胞數目和檢測信號的相關性。

圖 4 CHO-K1 細胞上的 DMSO 耐受結果。

圖 5 使用 CHO-K1 細胞，對秋水仙堿（A） ，5-氟尿嘧啶核苷（B），6-巰基嘌呤（C）的細胞毒性實驗評估。

圖 6 采用 Z’ 表針該實驗的穩定性

表 1 使用 CHO-K1 細胞，采用 ATPlite 1step luminescence assay 測試得到的 CV 和 z’。分別采用秋水仙素和 DMSO 做為陽性和陰性對照。

結論

該研究展現了應用 ATPlite 1step luminescence assay 以及 VICTOR NIVO™ 多模式酶標儀檢測細胞毒性的成功案例。VICTOR NIVO™ 一體化的安裝化學發光檢測模式適用于對應的檢測方法并可靈活調整。

ATPlite 1step luminescence assay 簡易性和穩定性的優勢有利于對應的細胞系的條件優化，動態范圍和線性條件符合方法開發的要求。高數值的 z’ 和低數值的誤差數據展現了該方法測試大量化合物的適用性。