皖儀科技液相色譜手性氨基酸應用專機系統(tǒng)

氨基酸是構成蛋白質的基本組成單位，同時也直接參與許多生命活動。在構成人體蛋白質的20種基本氨基酸中，除了甘氨酸外都具有手性，因此這些氨基酸都存在著L型和D型兩種手性同分異構體。

生命體中D型氨基酸的含量水平和各種生命現(xiàn)象息息相關，可以反映諸如疾病的發(fā)生和進程、細菌的感染和繁殖等。例如，血液中D-絲氨酸、D-脯氨酸和D-天冬氨酸的水平與腎功能密切相關，而D-天冬氨酸和D-脯氨酸的水平與糖尿病密切相關。

現(xiàn)代食品以及營養(yǎng)學上對于氨基酸手性異構體的分析也具有很大的意義。例如，牛奶中D-丙氨酸的濃度升高可以揭示微生物對牛奶的污染，葡萄酒和醋中的D-脯氨酸含量，則可被用于鑒定產品的發(fā)酵年份。

現(xiàn)有成熟的氨基酸檢測方法，包括茚三酮染色以及氨基酸分析儀等，都不涉及氨基酸手性異構體的測定。氨基酸手性異構體的分離檢測常用的方法有化學拆分法和物理拆分法?；瘜W拆分法工藝較為成熟，多用于工業(yè)生產，但是產品的拆分率、產物光學純度都不高，污染和能耗也較大，不適用于樣品的精確檢測分析。

物理拆分法包括膜拆分、毛細管電泳拆分、色譜拆分等。其中膜拆分受制于膜的穩(wěn)定性和使用壽命，不適用于高通量快速檢測分析；毛細管電泳拆分盡管分辨率高，但是一次只能拆分一種或少數(shù)幾種氨基酸的手性異構體，不適用于復雜實際樣品的分析檢測；色譜拆分法適用范圍較廣、靈敏度較高，能實現(xiàn)復雜樣品中的氨基酸手性異構體檢測分析。

但是色譜拆分氨基酸手性異構體需要采用昂貴的手性色譜柱。并且由于大部分氨基酸在紫外光區(qū)沒有吸收和特征熒光，因此在常用的色譜紫外檢測器中的效果并不好。為了解決以上問題，通常對待檢測含手性氨基酸的樣品進行色譜柱前衍生，以提高對手性氨基酸的檢測靈敏度和色譜分離度。本方法是一種簡單、靈敏且可重復的自動柱前衍生化對28種手性氨基酸分離的檢測方法。

1 方法原理

氨基酸手性衍生試劑可以分為羧基衍生試劑和胺基衍生試劑，這些衍生化試劑自身具有手性，在與待測的氨基酸樣品通過化學反應結合后，使待測的氨基酸對映異構體引入額外的手性中心，成為非對映異構體，從而可以在非手性色譜柱中實現(xiàn)分離。在此方法中，使用鄰苯二甲醛 (OPA)與N-異丁?；?/span>-L-半胱氨酸(IBLC)，與手性氨基酸反應形成了熒光非對映異構體。衍生過程中如圖1所示。

    圖1 衍生試劑與氨基酸反應過程儀器配置及實驗方法

· 儀器配置清單

· 試劑和標準品制備

· 標準品清單

· 試劑清單
單標制備：稱取單標適量，加0.1 mol HCL(用量筒量取4.1mL密度為1.19g/cm3質量分數(shù)為37%的濃鹽酸倒入裝有適量的純水的燒杯中，轉移至500mL容量瓶中定容)溶解定容，再用水稀釋制成所需的濃度。

混標制備：移取單標儲備液加水稀釋制成混標對照品溶液。硼酸溶液：硼酸鹽緩沖液（購買的成品，ph10.2）。衍生溶液：稱取IBLC試劑約0.2486g、OPA試劑約0.1824g置5mL容量瓶中，加硼酸溶液溶解并定容至刻度，混勻即得。0.1%乙酸溶液：移取1mL乙酸加水溶解定容至1000mL，混勻即得。50mM乙酸鈉：準確稱取4.101g無水乙酸鈉，用水定容至1000mL，用乙酸溶液調節(jié)pH7.0。

色譜條件如下圖所示:

進樣器衍生程序：如下圖所示。注：A1、B1、C1、D1位置溶液分別為硼酸溶液、衍生溶液、0.1%乙酸溶液、標樣。

實驗結果

· 氨基酸線性圖與線性數(shù)據(jù)下圖各項數(shù)據(jù)可知，28種氨基酸線性良好，R值均在0.999以上，完全滿足各種實驗分析需求。

· 分離度（氨基酸出峰位置譜圖與數(shù)據(jù)結果）

由上圖及上表中數(shù)據(jù)顯示，手性氨基酸峰型較好，分離度均在1.2以上，分離效果較好。

總結

本應用介紹的分析方法，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3600系列配置熒光檢測器、具備在線衍生功能的針在流路進樣器，使用OPA及IBLC衍生試劑，實驗結果顯示：手性氨基酸線性良好，R值均在0.999以上，各個氨基酸峰型較好，分離度均在1.2以上，分離效果好。說明了該方法配備皖儀科技LC3600系列儀器檢測手性氨基酸的可行性。