螢光素酶與螢光素底物反應產生的發光現象多應用于生物發光成像。利用螢光素酶基因標記細胞，注射螢光素底物后檢測螢光強度，可實時監 測目的細胞的生長狀況與藥物使用效果。由于螢光反應中還涉及ATP，因而也可利用ATP對體系的影響指示能量或生命狀態。

一，D-螢光素鉀鹽的原理

螢光素酶在ATP、Mg2+和O2的條件下催化D-螢光素鉀鹽進行氧化脫羧反應，發出平均波長為560nm的藍綠色熒光。當螢光素鉀鹽過

量時，產生的光量子數與螢光素酶的濃度呈正相關性。由于其方便檢測、定量準確、在生物技術領域有著非常廣泛的應用，特別是體內活體成

像領域和報告基因技術領域。

二，D-螢光素鉀鹽的使用方法

1. 溶液的制備
D-熒光素鉀鹽的溶液可以用于染色、標記、檢測等多種應用。
制備D-熒光素鉀鹽溶液的方法：
a.首先稱取適量的D-熒光素鉀鹽，加入適量的去離子水中后進行均勻攪拌；
b.使用過濾膜將溶液過濾，除菌。
c.將D-熒光素鉀鹽溶液調節至所需要的濃度。

2. 染色實驗過程
D-熒光素鉀鹽可以用于細胞染色、組織染色等染色實驗，實驗方法如下：
a.首先將細胞或組織樣本固定在載玻片上。
b.然后加入適量的D-熒光素鉀鹽溶液，使試劑溶液可以覆蓋樣本。
c.在黑暗條件下可以孵育一段時間，使D-熒光素鉀鹽充分滲透入細胞或組織中。
d.使用PBS緩沖液洗滌樣本，去除多余的D-熒光素鉀鹽。
e.在顯微鏡下觀察樣本，觀察樣品的熒光信號。

3. 實驗標記
D-熒光素鉀鹽也可以用于標記蛋白質、核酸等生物分子。
實驗標記方法：
a.首先將蛋白質或核酸與d-熒光素鉀鹽共同孵育。
b.再用凝膠電泳等方法分離標記后的生物分子。
c.最后在熒光顯微鏡下觀察標記后的生物分子即可。

4. 檢測方法
D-熒光素鉀鹽可用于檢測生物分子的存在和濃度。
D-熒光素鉀鹽檢測方法：
a.將d-熒光素鉀鹽與待檢測的生物分子進行共同孵育。
b.用凝膠電泳等方法分離孵育后的混合物。
c.在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，即可判斷生物分子的存在和濃度。

三，逐典D-螢光素鉀鹽優勢

1.高純度（HPLC驗證純度≥99%)

2.優異的生物發光性能

3.高溶解度（>40mg/ml)

四，應用場景

D-熒光素鉀鹽在不同領域具有多種應用場景。其中包括蛋白表達研究、抗腫瘤或抗病物研究以及mRNA疫苗開發等。

蛋白表達研究：將Luc基因插入需要研究的蛋白中，可用于定量目標蛋白在實驗動物體內的表達情況。

抗腫瘤或抗病物：在腫瘤細胞或病毒中導入Luc基因，建立腫瘤或病毒感染小鼠模型，注射藥物后，通過活體成像技術觀測腫瘤大小或病毒感染的變化。

mRNA疫苗開發：在mRNA中插入Luc基因，脂質體包裹后注射實驗動物后，可通過活體成像技術可觀測疫苗的免疫效果。

五，應用案例分享

六，常見問題答疑

Q:D-螢光素鉀鹽的純度是多少？純度大小對實驗有影響嗎？

A:D-螢光素鉀鹽純度≥99 %，螢光素純度越高，相應污染物含量越低，相反則越高，污染物濃度過高將抑制某些酶和細胞中的生物學過程，可能會給實驗結果帶來偏差，并且可能會對實驗動物造成傷害。

Q:D-螢光素鉀鹽溶解度是多少？其溶液穩定嗎？

A:D-螢光素鉀鹽溶解度在40 mg/ml以上，其水溶液短期內存放于-80℃，對實驗效果沒有明顯影響。對于部分條件較敏感的實驗，為了控制實驗中的可變因素，推薦反應液新鮮配制。例如，熒光素酶過低、非最適的反應條件等都需要高質量的底物才能進行反應。

Q:D-螢光素鉀鹽的建議用量是多少？

A:活體成像：以10 μL/g體重確定注射量。每只小鼠接受150 mg D-螢光素鉀鹽/kg體重（如對于體重為10 g的小鼠，需要注射100 μL以提供1.5 mg D-螢光素鉀鹽）。

體外成像：一般使用150μg/ml的工作液用于體外細胞成像。

Tips: 注射方式、動物類型以及體重等都會影響信號的發射，需要適當摸索，待螢光信號達到穩定平臺期，再用相應儀器進行成像分析。

Q:配置好的D-螢光素鉀鹽溶液如何儲存？

A:工作液現配現用，理想情況下，配置好的儲存液可于-20℃儲存較短時間。如有必要，螢光素溶液可在-20℃儲存長達3周。

Tips: 上述溶液在任何一種溫度長時間貯存下都有可能導致信號退化哦！

Q:螢光素（酶）底物的形式有哪些？

A:分為D-螢光素游離酸、D-螢光素鉀鹽和D-螢光素鈉鹽，由于水溶性高，因此鉀鹽和鈉鹽通常是通用的兩種檢測底物，其中又以鉀鹽作為活體動物檢測使用的主要形式。

Q:如何確定不同模型的峰值信號時間?

A:生物發光信號的動力學具有組織依賴性。建議每5-10min對動物進行一次成像，最多40 min，為每個新模型創建一個動力學曲線。(常見信號峰值時間點在10-15 min左右，螢光反應發光一般在30 min后衰減，3 h后消失。)具體詳見逐典D-螢光素鉀鹽說明書“螢光素動力學曲線制備”。

Q:螢光素底物可以透過血腦屏障嗎？

A:螢光素底物約280 Da，螢光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

Q:螢光素酶的表達穩定性如何？

A:螢光素酶基因能夠通過穩定篩選等過程插到細胞染色體內，當細胞進行分裂、轉移、分化從而進行持續穩定的表達，螢光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細胞才能持續表達螢光素酶。