MX10362.1 v.A

  細(xì)胞膜流動性（fluidity）PDA熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞膜流動性（fluidity）PDA熒光檢測試劑是一種旨在通過苯并芘癸酸熒光染料，選擇性地與細(xì)胞膜整合，并與之產(chǎn)生空間交互作用，形成激基締合物，其熒光散發(fā)波長的轉(zhuǎn)移，即熒光比值的增強(qiáng)或減弱，來分析膜流動性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體或動物貼壁或懸浮細(xì)胞膜流動性的動力學(xué)檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)微管以及微絲的動力學(xué)特征和微泡和囊泡內(nèi)脂質(zhì)的流動動力學(xué)，即流變學(xué)（rheological）細(xì)胞功能，受到細(xì)胞膜流動性（fluidity）或粘性（viscosity）調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞膜酶系的活化，微管和微絲的特定裝配或流動，化學(xué)引誘物受體親和力的強(qiáng)化，膜結(jié)構(gòu)和功能的作用等。一旦調(diào)節(jié)失衡，會導(dǎo)致病理演變或膜性變異。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid；PDA）為多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbon）化合物，一種親脂性苯并芘熒光探針染料，用于膜生物物理學(xué)研究：一，具有親脂性； 第二，與細(xì)胞膜脂質(zhì)具有類似性（analog），可以與細(xì)胞膜整合；第三，進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)空間后，與之產(chǎn)生交互作用，形成激基締合物（eximer），其熒光散發(fā)波長由372nm轉(zhuǎn)移到470nm，通過締合物和單體的熒光比值（ratio），分析膜流動性強(qiáng)弱，包括動力學(xué)，影響因子等。  

產(chǎn)品內(nèi)容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀釋液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

  強(qiáng)化液（Reagent D）            微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離操作

細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞脫落操作

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光定性分析

比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent B）和  強(qiáng)化液（Reagent D）放進(jìn)25℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后分別移出xx微升  染色液（Reagent A）和xx微升  強(qiáng)化液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入980微升  稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置（共5次操作量），并標(biāo)記為  染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

一、直接法

1． 準(zhǔn)備1個96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約1 X 10⁵細(xì)胞數(shù)）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 輕輕沿著孔壁加入xx微升   清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去  清理液（Reagent C）

5． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀釋液（Reagent B）和  強(qiáng)化液（Reagent D）的  染色工作液，覆蓋培養(yǎng)孔表面

6． 放進(jìn)25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）

7． 小心抽去  染色工作液

8． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

9． 小心抽去  清理液（Reagent C）

10． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至9一次

11． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

12． 選擇下列檢測：

一、 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm，干涉濾波器405nm波長 ）――可見淺藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度明顯，表明膜流動性減弱

2） 激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長470nm）――可見深藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明膜流動性減弱

二、即刻在熒光酶標(biāo)儀檢測（激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm和470nm）：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流動性強(qiáng)

二、間接法

1． 準(zhǔn)備1個12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約2 X 10⁶細(xì)胞數(shù)）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 加入xx毫升   清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去xx毫升   清理液（Reagent C）

5． 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面

6． 置入37℃培養(yǎng)箱1分種

7． 輕輕抖動培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落，然后加入1毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入1.5毫升離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步開始）

9． 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

10． 小心抽去上清液

11． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀釋液（Reagent B）和  強(qiáng)化液（Reagent D）的  染色工作液

12． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群

13． 放進(jìn)25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）

14． 放進(jìn)微型臺式微型離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

17． 放進(jìn)微型臺式微型離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

18． 小心抽去上清液

19． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟16至18一次

20． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

21． 進(jìn)行下列檢測

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

1． 混勻后，移出50微升在載玻片上

2． 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm，干涉濾波器405nm波長 ）――可見淺藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度明顯，表明膜流動性減弱

2）激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長470nm）――可見深藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明膜流動性減弱

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

1. 混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：觀察5000個細(xì)胞以上

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測定

1． 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2． 即刻進(jìn)行熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測定（激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm和470nm）：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流動性強(qiáng)

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次（0.2毫升工作液）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 待測細(xì)胞建議不要過于饑餓或過度生長

4． 操作時，避免污染母液，尤其是  稀釋液（Reagent B）

5． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析

6． 孵育時，避免光照

7． 本公司提供系列膜流動性檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰