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【技術(shù)方案】微孔板內(nèi)細(xì)胞固定和抗體染色自動化解決方案
以往，我們使用顯微鏡做熒光成像的時候，常常將樣本放在載玻片上。但是隨著樣本量增加，細(xì)胞實驗使用 96 孔和 384 孔微孔板逐漸成為趨勢，這與高內(nèi)涵（high-content analysis，HCA）分析不謀而合。
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高內(nèi)涵分析是一種高通量識別并分析由與細(xì)胞相互作用的物質(zhì)所帶來的細(xì)胞表型變化的方法。這些物質(zhì)包括小分子、受體配體和 RNAi，它們可能引起——增加或減少特定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表型變化、G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的內(nèi)化、核激素受體易位、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化以及細(xì)胞形態(tài)的變化。雖然通過明場成像（透射光）可以觀察一些細(xì)胞形態(tài)變化，但更多的形態(tài)學(xué)變化需要使用更有針對性的染色方案，比如抗體或者小分子熒光探針。
BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)支持高內(nèi)涵成像與分析
無論使用何種抗體和熒光染料的組合，對于低背景的特異性染色，都需要一系列的試劑添加和清洗步驟來去除未結(jié)合的抗體或染料。
安捷倫 BioTek 406 FX 洗板分液系統(tǒng)是一個模塊化的系統(tǒng)，具備分液和細(xì)胞清洗雙重功能。406 FX 可以通過觸控屏或者使用電腦上 LHC 軟件進(jìn)行控制和編程：
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快速清洗 96/384 孔板，且無需更換洗頭；
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最多 4 個注射器泵和 2 個蠕動泵分液器的組合允許同時添加 6 種試劑；
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蠕動泵結(jié)合 1μL 卡夾，允許用戶最大限度的減少試劑制備量；
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管路內(nèi)的試劑可回收；
注射器泵支持快速批量分液。
406 FX 洗板分液系統(tǒng)
一臺 406 FX 即可完成 96/384 孔板中制備細(xì)胞樣品所需的試劑添加和清洗步驟。成角度分液頭的獨特設(shè)計，有效保護(hù)單層細(xì)胞不受加液和清洗影響。
下面我們就一起了解下 406 FX 細(xì)胞分液系統(tǒng)在如何代替手工，完成在微孔板中固定和染色細(xì)胞的工作流程。
實驗方法
1
細(xì)胞培養(yǎng)與接種
將 HT-1080 細(xì)胞和 NIH3T3 細(xì)胞通過 406 FX 的蠕動泵 5μL卡夾分別接種到 96 孔板（黑色，透明底，貨號：204626-100，安捷倫）中，再使用第二蠕動泵添加不含細(xì)胞的完整培養(yǎng)基，使得每個孔體積均為 200μL。
2
細(xì)胞固定、透化與熒光染色
所有固定、透化和熒光染色所需要的試劑添加和細(xì)胞清洗步驟均由 406 FX 來完成（圖 1）。其中，對于昂貴的一抗和二抗，使用蠕動泵來添加，管路中的試劑可回收。
用于透化細(xì)胞的固定劑和細(xì)胞洗液則使用注射器泵添加。實驗所涉及的試劑、抗體和染料和詳細(xì)實驗步驟請查看原文。
圖 1. 固定和染色工作流程
3
細(xì)胞成像分析
使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行成像和分析。Cytation C10 將共聚焦光路與寬場顯微成像相結(jié)合，對于寬場成像，Cytation C10 將 LED 光源與高性能濾光片 cube 直接耦合，提供多色熒光成像，在本次實驗中使用 DAPI、GFP、TRITC 和 CY5 四個熒光通道。對于共聚焦，Cytation C10 使用激光器結(jié)合轉(zhuǎn)盤共聚焦的方式為有厚度的樣本提供更優(yōu)異的分辨率和光學(xué)層切能力。
圖 2. HT-1080 細(xì)胞固定染色
使用 Agilent BioTek 406 FX 洗滌分配器進(jìn)行液體處理，固定 HT-1080 細(xì)胞并對肌動蛋白（紅色）、微管蛋白（綠色）、細(xì)胞核（藍(lán)色）和線粒體（橙色）進(jìn)行染色。使用 Agilent BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)用 40 倍物鏡拼接成像（2×2）。
結(jié)果與討論
1
可變細(xì)胞數(shù)接種準(zhǔn)確性驗證
通過接種不同體積的細(xì)胞懸液，可以改變孔中的細(xì)胞數(shù)量。本實驗中，使用 406 FX 初級蠕動泵將相同細(xì)胞濃度的 NIH 3T3 細(xì)胞以不同體積接種至 96 孔板中，然后使用二級蠕動泵向孔內(nèi)添加培養(yǎng)基，至每孔體積均為 200μL，固定細(xì)胞并使用 Hoechst 33342 染色后通過成像進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計數(shù)結(jié)果與接種細(xì)胞時基于細(xì)胞濃度預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量具有良好的相關(guān)性（圖 3）。
圖 3. 可變細(xì)胞數(shù)接種
2
編程的靈活性驗證
406 FX 可以根據(jù)不同的實驗需求，在 2 個蠕動泵和 4 個注射器泵中靈活選擇進(jìn)行程序設(shè)置，比如實現(xiàn)一個簡化版的固定和染色步驟。如圖 4 中的 NIH3T3 細(xì)胞表達(dá) GFP，僅使用 DAPI 和 Texas Red 鬼筆環(huán)肽進(jìn)行復(fù)染，其固定和染色過程僅使用了洗板模塊，一個蠕動泵和兩個注射器泵。
圖 4. 406 FX 固定和染色后的三色熒光成像圖。表達(dá) GFP 的 NIH 3T3 細(xì)胞用 exas Red phalloidin（actin）染色，用 DAPI 染核。10 倍物鏡拍攝。
3
蠕動泵獨立分液，降本增效
406 FX 蠕動泵的卡夾采用 8 通道設(shè)計，8個通道既可以分裝相同的試劑，又可以分裝不同的試劑。8個通道獨立使用，在用來篩選熒光染料時可以節(jié)約染料和細(xì)胞，非常方便。圖 5 展示的是使用蠕動泵將不同的熒光染料組合加入到 4 個細(xì)胞孔里染色后的細(xì)胞圖像。
圖 5. 不同熒光標(biāo)記的 phalloidin 復(fù)染結(jié)果
該方法也同樣適用于檢測抗體特異性，檢測不同抗體的特異性時通常需要使用抗體陰性對照。如圖 6 所示，通過 406 FX 的一級和二級蠕動泵將6種不同的抗體混合物分別加入兩列細(xì)胞孔中，產(chǎn)生陰性對照：缺乏 rabbit anti-Tom20 一抗和對應(yīng)二抗的孔不顯示紅色熒光，同樣，缺乏 mouse anti-tubulin 和對應(yīng)二抗的孔不顯示綠色熒光。
圖 6. 抗體特異性驗證
結(jié)論
高內(nèi)涵分析目前在藥物發(fā)現(xiàn)過程中發(fā)揮著重要作用。基于顯微圖像的分析歷來需要大量的手工樣品處理，費時費力，并且容易產(chǎn)生可能導(dǎo)致偽影的錯誤處理。在這些繁瑣、重復(fù)的步驟中使用自動化液體處理設(shè)備，不僅提高了效率、減少了技術(shù)人員偏差，同時也讓研究人員得以將時間用在更重要的工作上。
406 FX 體積小巧，可以放入生物安全柜使用，進(jìn)行無菌操作，也可以與自動化設(shè)備整合，進(jìn)行自動化程度更高的樣本制備流程。
Agilent BenchCel 微孔板處理器與 Agilent BioTek 406 FX 洗板分液系統(tǒng)和 Cytation 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)集成
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