簡介：

  小鼠肝癌細胞H22（武漢普諾賽）又稱Hepatoma-22或Hepatoma 22，其分離自Balb/c小鼠腹水，由大連醫科學院建立。H22細胞為懸浮細胞，細胞形態呈淋巴母細胞樣。H22細胞常用于小鼠肝癌組織造模，在評估抗腫瘤藥物的療效、探究腫瘤微環境對肝癌進展的影響、揭示肝癌發生發展中的分子機制等方面的研究中有著廣泛應用。

主要耗材及儀器：

 15ml離心管、50ml離心管、凍存管、巴氏滴管、培養瓶、封口膜、CO2培養箱、離心機、顯微鏡、生物安全柜、RPIM-1640、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素（雙抗）、二甲基亞砜（DMSO）等等。

培養流程：

 1. 細胞復蘇

1)用酒精棉球擦拭生物安全柜臺面，準備好所需耗材，紫外30min，與此同時打開37℃恒溫水浴箱對所用試劑進行溫浴，同時也為復蘇細胞做準備；

2)按照RPIM-1640+10%FBS+1% P/S的比例配制（血清）細胞培養基，吹打混勻后按10倍細胞的體積（嚴格來講是10倍細胞的體積，實際操作中適當減少用量對細胞并無影響）分裝至15ml離心管中（最好依據所要復蘇細胞的量提前計算要配制的完培用量及所用離心管的數目）；

3)從液氮拿出H22細胞，在37℃恒溫水浴箱中快速晃動使其溶解（“快溶”），并將其轉移至提前分裝有完培的離心管中，吹打混勻；

4)1200rpm，離心3min；

5)棄去廢液，重新加入新的完培，重懸細胞后將其加入培養瓶中（完培的用量視培養瓶大小而定，25cm²用量3-5ml；75cm²用量10-15ml）;

6)蓋上培養瓶蓋子，以劃“十字”的方式晃動培養瓶，以使細胞分布均勻，鏡下觀察細胞均勻分布，置于37℃，5%-10% CO2培養箱中進行培養，完成細胞復蘇。

2. 細胞傳代

1)鏡下觀察細胞的生長情況，待細胞生長至80%以上時即可進行傳代；

2)收集培養瓶中的細胞至15min離心管中，1200rpm，離心3min，棄去上清；

3)等待離心的過程中，取出T25培養瓶（此時培養瓶數應為之前培養瓶數的兩倍哦），做好標記，并分別加入4ml（血清）細胞培養基；

4)離心結束后棄去上清，向細胞沉淀中加入2ml完培，輕輕吹打重懸細胞，混勻后各取1ml細胞懸液分別加入新培養瓶中，蓋上蓋子，混勻置于培養箱中培養即可完成H22細胞傳代。

3. 細胞凍存

1)從培養箱中取出培養瓶，轉移細胞至15ml離心管中，1200rpm，離心3min；

2)等待離心的過程中，按照55% RPIM-1640+40% FBS+5% DMSO的比例配制凍存液；

3)離心結束后，棄去上清，向離心管中加入凍存液（凍存液用量視分裝的管數而定），重懸細胞，分裝于凍存管中，做好標記并封口；

4)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍”），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出細胞置于液氮罐中保存。

四、注意事項

1．一定要有無菌意識，以防細胞被污染，實驗者雙手及所有物品在進入生物安全柜和培養箱前均應用75%乙醇進行表面消毒；

2．復蘇細胞時，不可讓水浴鍋的水位沒過凍存管管口，凍存管中僅剩一小塊冰塊時即可從水浴鍋中拿出，用其余溫使其融化；

3．生物安全柜在使用前后要用75%乙醇擦拭消毒，并紫外30min；

4．重懸細胞時動作一定要輕柔，以防對細胞造成機械性損傷；

5．操作過程中手部不要從培養瓶瓶口、離心管管口等部位經過；

6．生物安全柜最好嚴格按照清潔區-半污染區-污染區進行分區，以免造成污染。

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