人原代肝細(xì)胞(Primary human hepatocytes, PHH)一直被視為毒理學(xué)領(lǐng)域中先進(jìn)的體外人體肝臟模型系統(tǒng)。然而，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法對這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)染性研究一直具有挑戰(zhàn)性。且隨著培養(yǎng)過程的展開，PHH往往會快速失去其典型的肝功能，這限制了進(jìn)一步研究的深入。Lonza帶來的新研究旨在優(yōu)化冷凍保存的PHH的解凍、轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)程序，以期能夠持續(xù)保持其穩(wěn)定性和肝細(xì)胞功能。研究中對轉(zhuǎn)染7天后的肝臟細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染效率和肝細(xì)胞功能的綜合分析，以分析這一優(yōu)化過程的成效。

那么就讓我們來看看具體用到了哪些設(shè)備與程序，以及這7天的報告[1]吧!

01

設(shè)備

· 4D Nucleofector™ Core unit(Catalog# AAF-1003B, Lonza)

· 4D Nucleofector™ X unit(Catalog# AAF-1003X, Lonza)

02

試劑

· Cryopreserved Primary Human Hepatocytes(Catalog# HUCPI, Lonza)

· Hepatocyte culture media: HCM Bullet Kit(Catalog# CC-3198, Lonza)

· P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit L(Catalog# V4XP-3024, Lonza)

· Matrigel(Corning)

· Cleancap mCherry RNA(TriLink)

· CellTiter-Blue Cell Viability Assay(Promega)

· Human Albumin ELISA Kit(Bethyl)

· Cholyl-lysyl-flurescein(CLF) staining(Corning)

03

結(jié)果

使用EX-147程序，觀察到高達(dá)68%的DNA轉(zhuǎn)染效率。白蛋白分泌和細(xì)胞色素p450活性在轉(zhuǎn)染后24小時明顯可檢測到，但部分不能持續(xù)較長時間(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們推薦EX147程序用于高效的短期DNA轉(zhuǎn)染。

使用DS-150程序，DNA的效率高達(dá)20%，mRNA的效率高達(dá)85%，并持續(xù)7天。轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞活力和白蛋白分泌略有下降，但隨著時間的推移逐漸恢復(fù)。與對照培養(yǎng)相比，CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4活性在60%至80%之間。轉(zhuǎn)染的PHH形成復(fù)雜的、分支的膽管網(wǎng)絡(luò)。我們推薦DS-150程序，用于siRNA和mRNA的高效轉(zhuǎn)染，以及轉(zhuǎn)染后長期培養(yǎng)的中等水平DNA轉(zhuǎn)染。

04

結(jié)論

我們提出了在冷凍保存的PHH中高效表達(dá)DNA和mRNA的研究方案。通過Lonza的研究表明，使用DS-150方案后，轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞的功能可高度保存7天。這一方案有助于使轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞能夠產(chǎn)生更復(fù)雜的長期體外肝臟模型。