活性氧自由基（ROS）是氧氣正常代謝的自然產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著重要作用。在與氧化應(yīng)激相關(guān)的條件下，ROS水平會(huì)顯著增加。ROS的積累可能?chē)?yán)重?fù)p傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)。氧化應(yīng)激在心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、中風(fēng)、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等研究中起著重要作用。ROS檢測(cè)可幫助確定氧化應(yīng)激如何調(diào)節(jié)各種細(xì)胞內(nèi)途徑。EZMeta™活性氧自由基（ROS）檢測(cè)熒光試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單、敏感、快速的ROS檢測(cè)方法。其原理基于熒光探針DCFH-DA。DCFH-DA是一種細(xì)胞滲透敏感的探針，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）。該探針在通過(guò)活細(xì)胞膜時(shí)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為DCFH。DCFH無(wú)熒光并且不能穿透細(xì)胞膜，但可以被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化并產(chǎn)生熒光的DCF。然后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)，可以分析細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的水平。

艾美捷Biogradetech活性氧 (ROS) 含量檢測(cè)試劑盒：

貨號(hào)：D-AKC1910

規(guī)格：50T / 100T

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于-20°C，避光，保存12個(gè)月

適用樣本：細(xì)胞

提供的材料和儲(chǔ)存條件：

分析程訊：

對(duì)于刺激時(shí)間較短的細(xì)胞（通常少于2小時(shí)），建議先加載探針，然后用活性氧自由基陽(yáng)性對(duì)照物或感興趣的藥物刺激細(xì)胞；對(duì)于需要長(zhǎng)時(shí)間刺激的細(xì)胞（通常超過(guò)6小時(shí)），建議在加載探針之前用活性氧自由基陽(yáng)性對(duì)照物或感興趣的藥物刺激細(xì)胞，這里只提供后一種實(shí)驗(yàn)方法，步驟如下：

1. 原位加載探針（僅適用于附著細(xì)胞）

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：在測(cè)試前一天放置細(xì)胞板，確保細(xì)胞數(shù)目小于5×10^5/mL。

b) 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入無(wú)血清稀釋藥物處理細(xì)胞，在黑暗中在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間取決于藥物特性和細(xì)胞類(lèi)型。

c) （可選）陽(yáng)性對(duì)照：用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細(xì)胞在黑暗中孵育37°C，時(shí)間為30分鐘至4小時(shí)。為了提高活性氧自由基的水平，不同細(xì)胞類(lèi)型的實(shí)際時(shí)間不同。例如，HeLa細(xì)胞需要處理30-60分鐘。注意：陽(yáng)性對(duì)照僅在陽(yáng)性對(duì)照孔中需要，其他實(shí)驗(yàn)組不需要。

d) 活性氧自由基探針的制備：用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。

e) 加載活性氧自由基探針：去除處理藥物，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，加入適量稀釋的DCFH-DA工作溶液，細(xì)胞需要完-全覆蓋，例如6孔板通常添加不少于1 mL/孔，96孔板通常添加不少于100 μL/孔。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育30分鐘。

f) 清洗細(xì)胞：細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌1-2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。

2. 收集細(xì)胞并加載探針（適用于附著細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞。需要確保用于測(cè)試的細(xì)胞狀態(tài)良好。根據(jù)適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ鍧嵅⑹占銐驍?shù)量的細(xì)胞。

b) 藥物誘導(dǎo)：收集的細(xì)胞懸浮在適量的稀釋藥物中，在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育。實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間可以根據(jù)藥物特性和細(xì)胞類(lèi)型確定。

c) （可選）陽(yáng)性對(duì)照：用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性對(duì)照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細(xì)胞在黑暗中孵育37°C，時(shí)間為30分鐘至4小時(shí)。為了提高活性氧自由基的水平，不同細(xì)胞類(lèi)型的實(shí)際時(shí)間不同。例如，HeLa細(xì)胞需要處理30-60分鐘。

d) 活性氧自由基探針的制備：用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。

e) 探針加載：離心收集細(xì)胞，去除處理藥物，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，再次離心收集細(xì)胞，加入稀釋的探針，使細(xì)胞密度為1.0×10^6-2.0×10^7。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育30分鐘。注意：細(xì)胞密度應(yīng)根據(jù)后續(xù)的檢測(cè)系統(tǒng)、檢測(cè)方法和總檢測(cè)量進(jìn)行調(diào)整。例如，對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，單管中的細(xì)胞數(shù)目不應(yīng)少于10^4且不超過(guò)10^6。

f) 清洗細(xì)胞：用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。

3.熒光顯微鏡照片

a) 附著細(xì)胞（步驟1.f）可以直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)于懸浮細(xì)胞（步驟2.f），將25-50 μL細(xì)胞懸浮液滴在顯微鏡載玻片上，用蓋玻片覆蓋進(jìn)行觀察。

b) 在熒光顯微鏡下，使用FITC濾光片觀察熒光，并去除背景以觀察熒光變化。

4. 流式細(xì)胞術(shù)的操作和分析方法

a) 附著細(xì)胞（步驟1.f）用胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸浮液；對(duì)于懸浮細(xì)胞（步驟2.f），直接收集細(xì)胞。細(xì)胞用0.5-1 mL PBS（0.5-1×10^5/mL）重新懸浮。

b) 在流式細(xì)胞術(shù)中，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。可以實(shí)時(shí)或定時(shí)檢測(cè)刺激前后熒光強(qiáng)度的變化。

該試劑僅用于科學(xué)研究領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。