1、冰凍切片固定
冰凍切片37℃烘烤10至20分鐘,控干水分,置于4%多聚甲醛固定30min。于PBS緩沖液中晃動洗滌3次,每次5分鐘。
2、抗原修復(fù)
將切片浸沒在升滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(PH8.0)的修復(fù)盆中,置于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)條件:中火8min至沸——停火8min保溫——中低火7min(整個過程需防止修復(fù)液過度蒸發(fā),切勿干片。
自然冷卻后,將切片置于PBS緩沖液中。然后在搖床上,晃動洗滌3次,每次5min。
3、畫圈血清封閉
切片稍甩干后,用組化筆在組織周圍畫圈,滴加組織自發(fā)熒光淬滅劑A液,室溫孵育30min,純水洗5分鐘,接著滴加BSA牛血清白蛋白,封閉30min。
4、加一抗
輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加按比例配好的一抗后,切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜,這里推薦使用生科云選一抗實(shí)驗(yàn)效果更佳。
5、加二抗
切片浸沒在PBS緩沖液中,然后在生科云選搖床上,晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后,滴加生科云選熒光二抗,覆蓋組織,避光室溫孵育50min。這里推薦使用生科云選二抗實(shí)驗(yàn)效果更佳。
6、DAPI復(fù)染細(xì)胞核
切片浸沒在生科云選PBS緩沖液中,晃動洗滌3次,每次5min。甩干后,在圈內(nèi)滴加生科云選即用型DAPI染液,避光室溫孵育10min。
7、淬光組織自發(fā)熒光
切片置于生科云選PBS緩沖液中,晃動洗滌3次,每次5min。在圈內(nèi)滴加生科云選組織自發(fā)熒光淬滅劑B液,避光室溫孵育5min,水洗10min。
8、封片
切片稍甩干后用生科云選抗熒光淬滅封片劑封片,推薦使用生科云選配套試劑、耗材、儀器,實(shí)驗(yàn)效果更佳!
冰凍切片免疫熒光結(jié)果判讀:
DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色,陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光或綠光等。
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