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RNA提取原理與詳細步驟

來源:上海聯碩生物科技有限公司   2024年01月08日 14:10  

原理

用Trizol 的溶液提取,將總RNA與 DNA 和蛋白質分離。Trizol 是一種酸性溶液,含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白質和 RNase 變性。隨后進行離心。在酸性條件下,總 RNA 保留在上層水相中,而大部分 DNA 和蛋白質保留在中間相或下層有機相中。然后通過用異丙醇沉淀回收總 RNA。RNase 酶可以通過加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 來滅活。


步驟

組織:每 100 毫克新鮮組織加入 1 毫升 TRIzol 試劑,使用無菌手術刀在冰上切碎,并用無菌勻漿器或其他設備勻漿。

細胞:如果是細胞培養物,應在從培養箱中取出后立即進行處理。細胞在室溫(15-25 oC)下以 1000rpm 離心5 分鐘,然后丟棄上清液或從單層生長的細胞中去除培養基,用預冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 細胞加入 1 ml TRIzol 試劑。

1. 4°C 預冷離心機

2. 將組織或細胞裂解液轉移到 1.5毫升無RNA酶EP管中。置冰上,靜置 5 分鐘。

3. 每管加入200ul氯仿,充分混合后冰上靜置10分鐘,使核蛋白復合物解離。

4. 在 4°C 下以 13000 rpm離心 15 分鐘。期間,取一新EP管,加入500ul異丙醇,冰上預冷。

5. 離心后,將上層水相 (約500 ul) 轉移到該新的 EP管中。

6. 冰上靜置,酒精沉淀10min。

7. 離心, 13000 rpm, 10 分鐘。

8. 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀一次。

9. 12000rpm離心 5 分鐘。

10. 去掉上清,風干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分鐘。

11. 將 RNA 溶解在30-50ul DEPC 處理過的去離子水中(需根據RNA沉淀的量加水溶解)。

12. 進行分光光度分析以確定樣品濃度和純度。


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