HRP標記抗體之簡易過碘酸鈉法

來源：上海聯碩生物科技有限公司 2011年12月23日 10:25

2. 試劑及器材

（1）0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉（廣州化學試劑廠，批號830602）溶于蒸餾水10ml中。

（2）1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2M NaAc （1.361克/50ml） 3.7ml；0.2M HAc （0.601ml/50ml） 6.3ml；加蒸餾水至2,000ml。

（3）0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸餾水至50ml，再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

（4）NaBH4溶液（4mg/ml）：臨用時稱取NaBH4 4mg溶于1ml蒸餾水中。

（5）其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

3. 標記步驟

（1）稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

（2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

（3）將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。

（4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG（抗體，或SPA 5mg）在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。

（5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃ 2小時。

（6）將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。

（7）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃ 1小時。

（8）3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

（9）將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測），10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。

4. 結果判定

除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

IgG量（mg/ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.62

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