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液相色譜-串聯質譜法

來源:上海茁彩生物科技有限公司   2023年11月29日 09:25  

原理

材料與儀器

尿樣
睪酮 表睪酮 雄酮 苯膽烷醇酮 DHEA 內標甲基睪酮標準品 甲醇 甲酸 乙酸銨 磷酸緩沖液 β-葡萄糖醛酸甙酶Et2 O
三重四極桿串聯質譜儀 液相色譜系統 恒溫水浴鍋

步驟

1.樣品收集

2.樣品處理

取尿液210 mL于試管中,加入5 ng甲基睪酮(內標)210 mL pH6.8的磷酸緩沖液、150 μL β-葡萄糖醛酸甙酶(3 000 U),于80℃恒溫水浴中培養3 h,取出后冷卻至室溫。再加入3.5 mLEt2 O,混旋,離心,取出有機相并于60℃水浴中揮干,殘渣中加入100 μL 流動相溶解,供LC-MS/MS分析。


 

3.色譜及質譜條件

串聯質譜:采用電噴霧電離源( ES I) ,在多反應監測(MRM )正離子模式下掃描。碰撞氣(CAD )壓力為48 263 Pa;氣簾氣(CUR)壓力為68 948 Pa;霧化氣(GS1)壓力為241 317 Pa;輔助加熱氣(GS2)壓力為275 790 Pa。噴霧電壓為5 500 V;離子化溫度( TEM )500 ℃

選取各目標物的兩組特征母離子 /子離子對 ,分別優選其最佳碰撞電壓 (CE)和去簇電壓 (D P ) 。并采用豐度較強的一組母離子 /子離子對進行定量分析。

注意事項

1. 液相色譜分離條件的優化是本研究的關鍵。睪酮與表睪酮、雄酮與苯膽烷醇酮均為同分異構體 ,具有相同的母離子和子離子 ,必須依靠色譜方法進行分離。

2. 每個目標物選取低、中、高 3種濃度的樣品 ,3種濃度樣品與對應標準溶液測定結果相比求得回收率 ,并考察方法的精密度、準確度。


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