外泌體（Exosomes），是由活細胞分泌的一種脂質雙分子結構的胞外小泡（EV， Extracellular Vesicles），直徑約為30-150nm，廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液、精液、乳汁、羊水、肺泡灌洗液以及其他生物體液中。外泌體攜帶有多種蛋白質、脂類、RNA等重要信息，不僅在細胞與細胞間的物質和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標志物，或者作為藥物的天然載體用于治療。本文將為大家介紹如何運用活體成像技術進行外泌體相關內容的研究。

一，外泌體示蹤

圖1 外泌體（EVs）的獲取和標記

目前針對外泌體（EVs）的分離和純化已經有很多可選的成熟方法，針對其應用和藥物開發(fā)也有大量的研究結果。那么，如何在不影響其生物分布的情況下，在體內示蹤EVs是其作為藥物傳遞載體和治療藥物成功開發(fā)的關鍵。本研究借助影像學方法，分別評估了五種不同的光學和核示蹤劑標記方法對EVs體內生物分布的影響。

圖2 熒光（mCherry、DIR）標記EVs的小鼠活體成像圖像

研究人員選用小動物活體成像系統(tǒng)評估了熒光和生物發(fā)光標記EVs在動物體內的分布情況。使用熒光蛋白mCherry和熒光染料DIR標記EVs，通過活體圖像（2A、2E）、離體圖像（2B、2F）以及離體組織和組織裂解液熒光信號（2C、2D、2G、2H）的比較，可以清楚看到DIR標記的EVs在體內的生物分布情況，而mCherry標記的EVs受到動物組織高水平背景熒光的限制，與PBS空白對照組沒有形成明顯的分布差異，因而不適用于EVs的體內示蹤。

圖3 生物發(fā)光（Nanoluc）標記EVs的小鼠活體成像圖像

之后，研究人員選用了Nanoluc作為生物發(fā)光示蹤劑，用于EVs的體內監(jiān)測。然而，由于Nanoluc產生的短波長不容易穿透動物組織，使得活體動物深層器官（包括肝臟，脾臟和肺）的成像受到了限制，Nanoluc標記的EVs在活體（3A）和離體（3B、C、D）水平表現出不同的生物分布。同時，對EVs的基因修飾會導致其表面蛋白組成發(fā)生變化，影響其自身生理和生物分布，表明轉基因融合標記的方法（NanoLuc、Firefly、mCherry）并不適用于標記EVs。本研究通過一系列體內和體外影像檢測，發(fā)現DiR和放射性標記是EVs體內成像最敏感的示蹤劑。

二，外泌體載藥

圖4 納米電穿孔芯片制備包載核酸的外泌體

外泌體作為一種內源性的天然運載體，近年來備受青睞，成為體內核酸藥物運輸的一種新型工具。本研究開發(fā)了一種細胞納米穿孔方法，用于生產含有治療性mRNA和靶向肽的大量外泌體。相比傳統(tǒng)的脂質體轉染或電轉，產生包載大片段基因（6-9kb）的外泌體數量能夠提升50倍左右。該方法具有普適性，經驗證可在多種類型的細胞中顯著提高外泌體產率。

圖5 外泌體在小鼠體內的靶向分布圖像

生產出外泌體之后，需要對其作為藥物載體的靶向效果進行驗證。研究人員使用PTEN基因缺失的人源腦膠質瘤細胞系U87建立小鼠原位腦腫瘤模型，給予包載PTEN mRNA的外泌體，該外泌體經轉基因編輯靶向肽以增強其靶向性（Exo-T），并用親脂質型的熒光探針PKH26進行染色。利用小動物活體成像系統(tǒng)，研究人員對腦膠質瘤在小鼠體內的生長情況以及熒光標記的外泌體在小鼠體內的分布情況進行了監(jiān)測。結果顯示，與PBS空白對照、傳統(tǒng)的載藥載體陽離子脂質體（Turbo）以及未經靶向改造的外泌體組(Exosome)對比，尾靜脈注射4小時后，兩組外泌體均有明顯的腦靶向，而加了靶向肽的外泌體則能夠更好的富集到小鼠腦部。離體組織成像及熒光定量分析均證實了該結果（圖5）。

圖6 包載PTEN mRNA的外泌體抑瘤效果評價

利用腫瘤細胞攜帶的螢光素酶報告基因，研究人員同時監(jiān)測了腫瘤的生長情況，以完成對不同處理組的藥效學評價。結果顯示，經過靶向性改良的載藥外泌體具有顯著的抑瘤效果，并且一次給藥可以抑制腫瘤生長12天左右（圖6）。該系統(tǒng)的研發(fā)將有助于核酸藥物載體在臨床上的開發(fā)應用。