免疫熒光標記法

1、細胞膜上的免疫熒光檢測法

間接標記法

1)    制備單細胞懸液；

2)    細胞計數(shù)，取出 1× 106 個細胞于試管中；

3)   用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù) >90 ～ 95%；

4)   在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求），孵育 30 ～ 60 分鐘；

5)    PBS 洗滌 1 ～ 2 次， 1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清；

6)   加入二抗，孵育 20 ～ 30 分鐘；

7)   PBS 洗一次， 1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

8)   加 300μl PBS，上機檢測(若不能及時上機檢測， 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定，可放置 1 周)。

直接標記法

① ~ ③同間接標記法

④在試管中加入熒光標記的抗體，混勻，孵育 30 分鐘；

⑤用 PBS 洗 2 次， 1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上機檢測。

2、 細胞膜內(nèi)的免疫熒光標記法

間接免疫熒光標記法

1)   取已制備好的單細胞懸液，用 1 ～ 3%的多聚甲醛固定 30 分鐘（也可 4℃ 保存過夜 ）；

2)    用 PBS 洗兩次，棄上清；

3)    細胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200μl，室溫 10 分鐘；

4)    用 PBS 洗滌兩次；

5)   加入第一抗體， 室溫 30 ～ 60 分鐘，或 4℃過夜， 同時須設(shè)陰性對照或同 型對照管；

6)    用 PBS 洗滌兩次；

7)   加入二抗（熒光標記的抗體）室溫 20 分鐘，避光；

8)    用 PBS 洗滌 1 ～ 2 次，棄上清；

9)    重懸細胞于 500μlPBS 中，上機檢測。

直接熒光標記法

① ~ ⑤同間接熒光標記法；

加入熒光素標記好的抗體，避光 30 分鐘（同時做同型對照管）；

用 PBS 洗滌1~2次，棄上清；

加 300μl PBS 上機檢測。

細胞膜上及細胞內(nèi)雙標記法（ 直標法）

1)   取出已制備好的未固定的單細胞懸液 1× 10 6 個細胞于試管中； 2)    用 PBS 洗滌兩次；

3)   加入用熒光素標記的抗體來標記細胞膜上的抗原， 同時加上陰性對照管， 室溫孵育 20 分鐘；

4)   在試管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分鐘；

5)   PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘，棄上清;

6)   打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室溫 10 分鐘;

7)   用 PBS 洗滌兩次，棄上清;

8)   加入用熒光素標記的抗體，標記膜內(nèi)的抗原（標記膜內(nèi)的抗體的熒光素

的顏色與膜上標記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫 20 分鐘孵育;

9)    用 PBS 洗一遍棄上清；

10) 用 300μlPBS 重懸細胞，上機檢測

五、流式細胞術(shù)中的幾點注意事項：

1 、對照組的設(shè)置：

在流式細胞術(shù)中所測得的量都是相對值，不是絕對值。如需知道絕對值

時必須設(shè)置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。

（ 1 ）、陰性對照的設(shè)置

2 在實驗過程中，如做間接標記法，可設(shè)置與一抗無關(guān)的實驗，即在 實驗中不加一抗而只加上帶有熒光標記的第二抗體作為陰性對照

管，作為陰性對照。

2 在實驗過程中，假設(shè)做直接標記法，可設(shè)置理論上的陰性細胞作為  陰性對照管， 實驗過程及步驟與實驗組務(wù)必相同。（做間接標記法時 ，

同樣也可同時設(shè)置“ 陰性細胞” 的陰性對照管作為陰性對照。

2 在實驗過程中，假設(shè)做直接標記法，可將實驗組細胞，取一管，加

上與實驗抗體所標記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。 

（2）、陽性對照的設(shè)置：

在實驗過程中如涉及到表達缺失或減少的實驗，應(yīng)設(shè)置陽性對照組，其設(shè)置方法與陰性對照設(shè)置相同。

2、幾點建議：

1)   在實驗過程中， 在保證實驗的科學(xué)性和準確性的基礎(chǔ)上， 應(yīng)盡量減少實驗工 序和過程。由于間接標記法的工序多，實驗過程長， 如再加之操作的不熟練 ， 細胞更容易丟失和受損， 而造成實驗結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍 內(nèi)， 建議盡量做直接標記法而不去做間接標記法， 以保證實驗的真實性和準 確性。

2)    建議送檢細胞一定要足夠量， 一般要求 1× 106 個細胞。不要過少。因為，如 細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數(shù)， 結(jié)果也不可信。 細 胞量也不宜過多， 因細胞量太多加入的抗體或染料相對不足， 結(jié)果也由此受

影響。

3) 同一種細胞需同時做雙標記時， 須做雙標記的同型對照， 且兩種抗體所標記 的熒光顏色務(wù)必不同。