KRAS熱度已經(jīng)消退了？NO...據(jù)調(diào)查，現(xiàn)在除傳統(tǒng)針對KRAS靶點(diǎn)小分子藥物外，更多玩家嘗試新興療法征服這一“不可成藥”的難題，如疫苗，TCR-T療法等。KRAS可以被細(xì)胞外信號以及來自細(xì)胞器等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的信號所激活。在正常的生理環(huán)境下，野生型KRAS主要處于不活躍的GDP結(jié)合狀態(tài)。信號促使KRAS脫離GDP，并與GTP結(jié)合，將KRAS轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)。激活的KRAS能夠結(jié)合并激活效應(yīng)蛋白，如RAF激酶、PI3K和RalGDS，促進(jìn)下游級聯(lián)的信號通路，如MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。這些信號通路通過細(xì)胞復(fù)制、生長、分化和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。一個激活的致癌KRAS基因?qū)е乱粋€突變的KRAS蛋白，由于GTP水解率大大降低，異常長時間保持其活性GTP結(jié)合狀態(tài)。當(dāng)KRAS蛋白被困在“ON”位置時，下游效應(yīng)通路也保持活躍，細(xì)胞增殖率保持很高。其他仍然活躍的效應(yīng)通路包括那些促進(jìn)腫瘤發(fā)展過程的通路，如有絲分裂、細(xì)胞遷移、腫瘤侵襲和血管生成。 一、高通量篩選試劑盒HTRF®技術(shù)提供均相，免洗KRAS結(jié)合檢測試劑盒，通過這些已驗(yàn)證的試劑盒，可直接用于抑制劑篩選，無需優(yōu)化，每個試劑盒配有重組蛋白、檢測試劑和緩沖液。如下圖所示，使用抗Tag1-SOS1（供體）和抗Tag2-XL665（受體）檢測Tag1-SOS1與Tag2-KRAS-G12C之間的相互作用。當(dāng)供體和受體抗體由于SOS1和KRAS-G12C結(jié)合而接近時，供體抗體的激發(fā)觸發(fā)向受體抗體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），受體抗體在665nm處特異性發(fā)射。這種特異性信號與KRAS-G12C/SOS1相互作用的程度成正比。因此，化合物或抗體阻斷KRAS-G12C/SOS1的相互作用會導(dǎo)致HTRF®信號的減少。  
 使用已知抑制劑對試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，均獲得相應(yīng)較好的IC50并且與已報(bào)道文獻(xiàn)結(jié)果相一致。 
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 二、KRAS靶點(diǎn)相關(guān)蛋白全部KRAS相關(guān)蛋白均已原核表達(dá)系統(tǒng)（E.coli）進(jìn)行表達(dá)。通過HTRF方式驗(yàn)證其結(jié)合活性。 1、KRAS WTThe KRAS-WT activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- WT protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

2.KRAS-G12CThe KRAS-G12C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal. 3.KRAS-G12D The KRAS-G12D activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12D protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal
4.KRAS-G12RThe KRAS-G12R activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12R protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

5.KRAS-G12VThe KRAS- G12V activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- G12V protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
6.KRAS-G13CThe KRAS-G13C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G13C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
7.KRAS Q61HThe KRAS-Q61H activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-Q61H protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

8.SOS1 

9.RAF
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*以上KRAS蛋白無GTP bound，如需GTP bound，可聯(lián)系優(yōu)寧維。上述蛋白，常規(guī)規(guī)格有：50μg，100μg和1mg，如需更大規(guī)格，可聯(lián)系優(yōu)寧維定制。 三、Anti-Tag抗體話說，不想用試劑盒的情況下，如何建立assay呢？蛋白已經(jīng)有了，還差檢測抗體...這不就來了！Anti-Tag的HTRF熒光抗體，在實(shí)現(xiàn)高通量，操作簡便等其他技術(shù)優(yōu)勢的同時，可以為assay的建立提供最大的靈活性。無關(guān)乎蛋白本身，僅針對標(biāo)簽如His，GST，F(xiàn)LAG等，選擇對應(yīng)的配對抗體即可實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)開發(fā)。比如：參考上述蛋白KRAS G12C（his Tag）和SOS1（GST tag），選擇抗體配對有幾種方式可供參考：

 下圖為Anti-GST-Tb SOS1與Anti-his-XL665 KRAS G12C搭配組合展示。 
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 三、下游磷酸化蛋白檢測Alpha®和HTRF®技術(shù)基于細(xì)胞水平進(jìn)行下游KRAS信號通路的研究，包括MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。這些細(xì)胞信號分析能夠區(qū)分化合物調(diào)節(jié)下游KRAS通路的功效。HTRF®仍然利用夾心法原理，標(biāo)記的特異性抗體識別磷酸化蛋白和總蛋白從而進(jìn)行定量檢測。全過程無需洗滌，特異性好，靈敏度高。 

下圖為p-ERK（圖左）和p-NFkB（圖右）磷酸化試劑盒靈敏度與WB對比，靈敏度高出30倍不等。

與HTRF®技術(shù)不同，Alpha®雖然也是均相檢測檢測技術(shù)，但其基于化學(xué)發(fā)光原理，利用兩個微珠進(jìn)行檢測來實(shí)現(xiàn)更低的實(shí)驗(yàn)背景和超高靈敏度。一個抗體被生物素化并與鏈霉親和素包被的供體微珠結(jié)合，受體微珠則直接與另一個抗體結(jié)合。抗體與磷酸化蛋白（總蛋白）結(jié)合使供體和受體微珠靠近。供體微珠的激發(fā)使得單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微珠，從而發(fā)射615nm波長的光信號。Alpha®的檢測信號與樣本中存在的磷酸化蛋白（總蛋白）的數(shù)量成正比。Alpha®原理如下圖。 

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 四、3D細(xì)胞增殖


基于ATP的發(fā)光法測定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的分析原理。用適當(dāng)緩沖液直接裂解細(xì)胞后，對細(xì)胞ATP進(jìn)行定量。在裂解細(xì)胞釋放的ATP作用下，ATP與添加的熒光素反應(yīng)產(chǎn)生光。

ATPlite 3D and ATPlite 1step 3D Assay 操作流程如下：

ATPlite 3D檢測可以允許細(xì)胞密度較高情況下進(jìn)行檢測，并且比2D檢測效果明顯。
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四、微孔板耗材1.3D細(xì)胞培養(yǎng)板①板底為高度生物相容的，超低吸附力聚合物包被du有的合成聚合物MPC，源于細(xì)胞膜組分，與極性基團(tuán)的磷脂（磷脂酰膽堿）具有相同的結(jié)構(gòu)，提供自然生長環(huán)境，并消除批間差異。②易形成形態(tài)大小均勻的球體細(xì)胞球體高質(zhì)量形成率，細(xì)胞形態(tài)均已一致，板材的均勻性高，可隨時聚焦進(jìn)行圖片拍攝，提供重復(fù)性更高的數(shù)據(jù)及更高效更高質(zhì)量的成像。③無需更換培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)的佳選擇圓底板，性價比高。
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