細胞因子

疑惑解答

逐典細胞因子優(yōu)勢

1.非標簽純化

2.特異性強，純度高

3.全面覆蓋各類細胞培養(yǎng)所需

4.規(guī)格可根據(jù)需求定制

5.GMP和科研級別均可提供

6.具有改良型產(chǎn)品：IL-2 Pro擁有更高溶解度，IL-15 Pro 擁有更高活性

細胞因子(cytokine，CK)是由多種組織細胞(主要為免疫細胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白。細胞因子能介導(dǎo)細胞間的相互作用，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細胞生長、分化成熟、功能維持、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合和腫瘤消長等。

常見問題

問：常見細胞因子有哪些？有什么功能？

答：(1) 白細胞介素（interleukin, IL)：由淋巴細胞、單核細胞或其它非單個核細胞產(chǎn)生的細胞因子，在細胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血以及炎癥過程中起重要調(diào)節(jié)作用，凡命名的白細胞介素的cDNA基因克隆和表達均已成功，已報道有三十余種（IL-1―IL-38）。

(2) 集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)：根據(jù)不同細胞因子刺激造血干細胞或分化不同階段的造血細胞在半固體培養(yǎng)基中形成不同的細胞集落，不同CSF不僅可刺激不同發(fā)育階段的造血干細胞和祖細胞增殖的分化，還可促進成熟細胞的功能。

(3) 干擾素（interferon, IFN)各種不同的IFN生物學(xué)活性基本相同，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。

(4) 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF)：兩類TNF基本的生物學(xué)活性相似，除具有殺傷腫瘤細胞外，還有免疫調(diào)節(jié)、參與發(fā)熱和炎癥的發(fā)生。大劑量TNF-α可引起惡液質(zhì)，因而TNF-α又稱惡液質(zhì)素（cachectin)。

問：細胞因子凍干產(chǎn)品的使用要注意什么？

答：凍干粉產(chǎn)品在運輸過程中會有粉末黏在管壁或蓋上，使用前請勿開蓋并離心處理 20-30 秒（高速離心機，約13000 rpm），使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。亦可使用最高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機離心5分鐘（3000-3500rpm），也能達到類似的效果。雖然有時管中蛋白粉末不可見或者可視數(shù)量很少，我們的質(zhì)控體系保證每管中所含的蛋白量是準確且足量的。

問：細胞因子凍干產(chǎn)品如何溶解？

答：(1) 使用前準備：使用前先離心（見上文），使附于管蓋或管壁的蛋白沉于管底；

(2) 溶解液

①　要求用無菌去離子水溶解的產(chǎn)品，務(wù)必不可用鹽溶液，避免過高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出；不可用PBS或培養(yǎng)液（1640或DMEM等）直接溶解，否則蛋白可能無法溶解，從而導(dǎo)致蛋白活性不足或失活；

②　要求用鹽溶液溶解的產(chǎn)品，請依照說明書上的濃度，同樣也是為了避免過高的鹽濃度；

③　亦可聯(lián)系我們的技術(shù)支持獲得關(guān)于單獨產(chǎn)品的溶解液的選擇。

(3) 溶解到濃度：

①　我們建議最佳濃度一般不低于100 μg/mL，如10μg的凍干粉，則加入10 μL-100μL的溶解液；

②　高于或低于最佳濃度，細胞因子可能會不穩(wěn)定，或者聚集（aggregation），導(dǎo)致部分蛋白沉淀，影響其活性。高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法溶解；

③　用移液槍輕吹混勻，或?qū)⒐苌w蓋好后輕柔顛倒數(shù)次進行混勻，低速離心數(shù)秒；溶解時不可振蕩（vortex，即用渦旋儀進行快速振蕩），避免因化學(xué)鍵的斷裂造成蛋白失活；

④　將溶解后的蛋白在室溫放置數(shù)分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。建議將不易溶解（slow to dissolve）的蛋白用低速搖床促進其溶解。

(4) 溶解后的保存：

不建議用推薦的溶解液做進一步稀釋。溶液中的蛋白很容易黏附在凍存管壁，且很難與管壁分離。使用含有載體蛋白的溶液（該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液等）預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點，使細胞因子或重組蛋白不會黏于管壁，方可更好地保存蛋白溶液；

①　短期保存：在一般情況下，上文中建議的濃度是較高的。我們建議將該溶液用含載體蛋白（如0.1% BSA、10% FBS、5% HSA）的溶液進行稀釋，分裝存于4℃并于一周內(nèi)用完，分裝體積不要小于20μL。否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，從而影響其生物活性；

②　長期保存：若配置的溶液無法一次用盡，我們建議用含載體蛋白（如0.1% BSA、10% FBS、5% HSA）的溶液進一步稀釋，分裝凍存于-20℃至-80℃，分裝體積不要小于20μL；

③　在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動物或人的成分，我們建議選用小包裝，每次使用一支，用后即廢棄。或者用含5%海藻糖（Trehalose）的溶液來稀釋已溶解的細胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存，分裝體積不要小于20μL。

問：重組蛋白的檢測都有哪些？

答：基因序列：經(jīng)N端序列分析。必要時，使用SDS-PAGE，HPLC和質(zhì)譜分析等方法與標準品進行比對；

蛋白純度：

(1) 經(jīng)SDS-PAGE

(2) HPLC分析

生物活性：經(jīng)相關(guān)的體外或體內(nèi)生物活性檢測，詳見下文；

蛋白含量：

(1) 紫外分光光度

(2) BCA蛋白定量測定

(3) SDS-PAGE分析

(4) HPLC法與標準品比對

內(nèi)毒素含量：經(jīng)動態(tài)LAL（西方鱟試劑）法或TAL（東方鱟試劑）法測定；

無菌：所有蛋白溶液在分裝凍干前經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，在環(huán)境分裝、凍干及封蓋；

分子量：SDS-PAGE分析；

宿主蛋白殘留：熒光染色；

宿主DNA殘留：ELISA試劑盒；

支原體檢測：支原體試劑盒。

問：重組蛋白的生物活性是什么？

答：蛋白質(zhì)的生物活性是各種蛋白質(zhì)功能的體現(xiàn)。或者您可以理解只有蛋白質(zhì)有活性的概念，它才能執(zhí)行它的功能。具有生物活性的蛋白質(zhì)稱為活性蛋白質(zhì)，即具有生物活性的活性蛋白質(zhì)。從理論上講，天然蛋白都是活性蛋白，而重組蛋白并不總是活性蛋白，因為重組蛋白的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，其中許多因素對其生物活性至關(guān)重要，例如理想的表達系統(tǒng)、合適的表達載體、純化等。

1. ED50的計算：

逐典的蛋白產(chǎn)品ED50（即半數(shù)有效濃度，其定義是對特定細胞引起 50% 最大反應(yīng)的蛋白濃度，單位為ng/mL）可在蛋白產(chǎn)品COA中獲取，這種活性表示法僅適用于劑量反應(yīng)曲線呈 S 形的細胞因子。將1 ng/mL ED50 定義為 1 unit，則產(chǎn)品生物學(xué)活性 Specific Activity 的換算公式如下：

Specific Activity（units/mg）= 1 × 10 6 ÷ ED50（ng/mL）

以上計算公式并不適用于International Units（IU）和ED50的換算關(guān)系，我們建議采用國際標準品對比相同實驗獲得該蛋白的IU值。

2. 影響ED50的因素：

產(chǎn)品說明書中的實驗方案只是確認該產(chǎn)品的ED50，如果客戶的實驗類型與我們相同，則可以按照產(chǎn)品標定的生物活性進行實驗；若實驗采用了不同的細胞種類或方法，我們建議客戶按照梯度濃度通過實驗獲得最佳ED50值，并依據(jù)此數(shù)值制定相應(yīng)的實驗方案以及產(chǎn)品的添加量。