01背景

這篇文竟是關于拉曼自動化反饋控制多種補料成分以實現高接種密度增強型fed-batch平臺過程的研究論文。該研究旨在開發控制策略，通過在線拉曼光譜法監測和調整代謝物濃度，以實現高接種密度下的細胞培養過程中的高產量和穩定性。具體使用了增強型high inoculation density (HID)高接種密度培養fed-batch平臺過程來培養五個不同谷氨酰胺合成酶piggyBac®中國倉鼠卵巢細胞CHO克隆。通過在線拉曼光譜法連續監測殘余glucose葡萄糖、phenylalanine苯丙氨酸和methionine 甲硫氨酸的濃度變化，開發了partial least squares models偏最小二乘模型。通過持續監測殘余代謝物濃度，自動調整三種補充成分的補料速率，從而保持葡萄糖、苯丙氨酸和甲硫氨酸在期望的設定點上，并確保其他營養物質濃度在所有培養的克隆中保持在可接受的水平。

02材料與設備

細胞系與培養

使用了Lonza HID平臺的 GS piggyBac® CHO clones細胞系，共有5個克隆體。采用了100*10⁵的初始接種密度，在1L或者5L的體積進行培養。

模型建立

使用了SIMCA v16分別對glucose, phenylalanine and methionine進行建模處理。首先是光譜區域的選擇，主要是基于了在純水中他們各自的特征光譜范圍。其次，通過 first derivative, Savitzky-Golay smoothing and standard normalvariate normalization (SNV) 的方法對原始光譜進行了預處理。建立的模型結果如Table 1所示。

參考已知的文獻并結合所建模型的R²以及root mean squared error of estimation and cross-validation (RMSEE/RMSECV) ，初步判斷模型可用。分對于glucose, phenylalanine, and methionine，如果RMSEPs 是 < 1 g/L, 100 mg/L and 100 mg/L，則判斷結果模型結果是可用的。

03光譜采集與樣品分析

在線拉曼光譜的收集使用了來自于Endress +Hauser的RXN2 system系列，有著 785 nm的光源并內置了Runtime 6.2的操作系統。探頭使用了220 mm和420mm（分別在1L和5L的培養體積）的BioOptic探頭。采用了5sx150 scan的曝光時間和曝光次數，總時長大約是12.5min。對于glucose, phenylalanine和methionine在線監測數據，首先通過OPC的方式傳輸到Delta-V(Emerson)，再在Delta-V對三個參數分別建立基于PID算法和on–off的控制回路，在監測值低于目標值的時候，可以自動添加SF1, SF2和 SF3。SF1, SF2, and SF3對別對應了glucose, phenylalanine and methionine的補料。

離線的樣品是每日從HID的培養中取出送樣檢測。使用了來自于Nova Biomedical的Bioprofile FLEX2分化分析儀。對于氨基酸以及最后產物的分析分別使用了high-performanceliquid chromatography (HPLC)和Tridex Protein Analyzer (IdexHealth Sciences)

04結果


 

上訴三個圖分別為glucose, phenylalanine和methionine的自動控制情況以及SF1, SF2, and SF3在5個clones分別的添加總量。glucose的平均RMSEP是0.49 g/L (limit < 1 g/L), phenylalanine的平均RMSEP是40.72 mg/L (limit 100 mg/L) ,methionine的平均RMSEP是42.01 mg/L (limit 100 mg/L)，都是在可以接受的標準之內的。

除此之外，文章還對其他的組分進行了監測，以探究在HID平臺的自動回路控制培養模式對細胞生長代謝的影響。具體對比了培養體系中的histidine組氨酸、leucine亮氨酸、threonine蘇氨酸和ryptophan色氨酸的變化，以評估拉曼自動回路控制對殘留氨基酸濃度的影響。

可以看出，利用拉曼自動回路控制的方式，通過動態提供培養物所需的氨基酸，有助于降低克隆間代謝的差異性。

此外，為了進一步驗證拉曼自動控制的HID培養的效果，研究人員通過Peak VCC、Harvest VCC、 Harvest viability、Harvest lactate、Harvest NH₄、Harvest product concentration六個維度來評估對細胞生長和產量的實際影響。可以看出，在HID平臺上培養的所有克隆均獲得較高的Peak VCC(320.5±32.3×10⁵) cells/ mL)，且直到收獲當天，大多數HID培養保持在以上200.0×10⁵ cells/mL(4/5clones)。總的來說，除2 clone號外，在HID工藝上培養的所有克隆在收獲時都有很高的活力(2clone的收獲活力較低，是因為在培養結束時無意添加了堿基，導致VCC下降)。除2 clone，收獲時培養存活率均大于85%。

在HID培養過程中使用的自動培養策略的另一個好處是代謝副產物的低水平。乳酸和銨是代謝副產物，其積累與抑制細胞生長有關。總體而言，在HID工藝下培養的所有克隆的平均乳酸收獲濃度(0.8±0.5 g/L)和銨收獲濃度(0.07±0.02 g/L)均較低，這表明以該種控制策略培養，不僅對氨基酸副產物的積累影響很小，而且對其他常見抑制副產物的積累影響也很小。

最后，本研究使用的5個clone在HID培養過程中獲得了較高的收獲產物濃度(6.5±1.2 g/L)。相比之下，本研究中獲得的收獲產物濃度平均略高于之前所報道的(6.5±1.2 g/L)。也可以得出結論，在本研究中觀察到的較高的產品濃度，部分原因是由于提出的自動化策略可以維持高接種密度培養的營養需求，從而實現所需要補料操作的自動化，減少了危險副產品的積累。

05結論

該研究通過應用在線拉曼監控技術和自動化反饋控制策略，實現了高接種密度下的增強型細胞培養過程的穩定和高產量。這為生物制藥行業開發更高效、成本更低的生產過程提供了新的思路和方法。

Webster, T.A., Hadley, B.C., Dickson, M., Hodgkins, J., Olin, M., Wolnick, N., Armstrong, J., Mason, C. & Downey, B. 2023, "Automated Raman feed-back control of multiple supplemental feeds to enable an intensified high inoculation density fed-batch platform process", Bioprocess and biosystems engineering