細胞/組織線粒體內鈣離子熒光染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細胞/組織線粒體內鈣離子熒光染色試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Rhod-2-AM，進入線粒體后，與鈣離子結合，其熒光強度顯著增強，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光現象，來分析細胞/組織線粒體中總鈣離子的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞或組織（動物、人體等）內線粒體鈣離子的染色檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。

技術背景

鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結合鈣，其構成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。在細胞內，鈣離子主要儲存在線粒體和內質網等細胞器中。其中線粒體鈣離子在調節線粒體代謝、保持線粒體的ATP產量達到細胞需求，維持細胞內環境鈣離子平衡方面起著重要作用。Rhod-2-AM，羅丹明123（rhodamine 123）的衍生產物，進入細胞受到酯酶解離，同時其正電荷特性，特異性地聚集在線粒體里，與鈣離子結合產生熒光，由此用于測定線粒體內鈣離子水平。在熒光顯微鏡下，激發波長550nm，散發波長590nm，觀察紅色熒光現象。

產品內容

  清理液（Reagent A）            毫升

  染色液（Reagent B）        微升

  介導液（Reagent C）            微升

產品說明書               1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）和  介導液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細胞培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實驗步驟

一、 測定準備

1． 設定好（共聚焦）熒光顯微鏡（22℃）：激發波長550nm，散發波長590nm

2． 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出xx微升  介導液（Reagent C）和xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為  染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

二、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測

1）細胞樣品染色

1． 準備1個待測的細胞爬片樣品

2． 小心加上xx微升  清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面

3． 小心移去樣品上的  清理液（Reagent A）

4． 移取xx微升  清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管

5． 加入xx微升  染色工作液，混勻 

6． 小心加上上述  染色工作液到樣品上，覆蓋樣品表面

7． 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照

8． 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘，避免光照

9． 小心移去樣品上的  染色工作液

10． 小心加上xx微升新鮮的  清理液（Reagent A）

11． 小心移去  清理液（Reagent A）

12． 小心加上xx微升新鮮的  清理液（Reagent A）

13． 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘

14． 小心移去  清理液（Reagent A）

15． 蓋上蓋玻片

16． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長550nm，散發波長590nm（線粒體鈣離子呈現紅色）

2）組織樣品染色

1． 取出待測的5至10微米厚的冰凍切片（注意：使用快速冷凍處理－snap frozen的冰凍切片，不宜使用包埋處理）

2． 小心加上xx微升  清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面

3． 小心移去切片樣品上的  清理液（Reagent A）

4． 移取xx微升  清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管

5． 加入xx微升  染色工作液，混勻 

6． 小心加上上述  染色工作液到切片樣品上，覆蓋切片樣品表面

7． 室溫下孵育60分鐘，避免光照

8． 小心移去染色液

9． 小心移去  清理液（Reagent A）

10． 小心加上xx微升新鮮的  清理液（Reagent A）

11． 蓋上蓋玻片

12． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長550nm，散發波長590nm（線粒體鈣離子呈現紅色）

注意事項

1． 本產品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 避免使用EDTA等處理樣品

4． 孵育反應完成后即刻進行熒光分析

5． 如果背景染色過高，可以調整  染色工作液使用劑量（1：100至1：1000容量比）

6． 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感