(1)引物及濃度:①長度:15~30bp。②堿基:G+C含量以40%~60%為宜,ATGC最好隨機分布,避免5個以上的堿基成串排列。③避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)、兩條引物間互補,特別是3′端的互補。④引物3′端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴格要求配對。⑤與其它序列無明顯同源性。⑥濃度為0.1~1μmol或10~100pmol。
(2)酶及其濃度:催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100μl時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
(3)dNTP的質(zhì)量與濃度:dNTP應(yīng)為50~200μmol/L,4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),過高dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。
(4)模板:模板的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,避免DNA純化中的SDS和蛋白酶K等雜質(zhì)。
(5)Mg2+濃度:一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200μmol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
(6)溫度與時間:①變性:93℃~94lmin℃,過高或過低的溫度影響酶的活性。②退火:取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。一般高于Tm值5℃~10℃,時間為30~60s。③延伸:常用溫度為72℃,時間根據(jù)待擴增片段的長度而定。
(7)循環(huán)次數(shù):主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30~40次,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。
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