瓊脂糖是實驗室常用的試劑之一,但是瓊脂糖凝膠電泳的制備過程也不簡單,接下來就為大家詳細(xì)介紹一下制備過程。
一、用稱量紙片電子天平取0.3g的瓊脂粉;
二、配30ML的1*10的TBST緩沖液與100ml的三角燒瓶里;
三、倒入瓊脂粉搖勻,并轉(zhuǎn)到微波爐中加熱溶解;
四、用手套取出到?jīng)鏊陨粤罌鲋翜責(zé)岷螅s60℃),加入核酸酶(Eb替代物)2ul;要邊加邊搖勻,使之充分搖勻;
五、取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,形成模子。
將內(nèi)槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。
室溫下靜置直至凝膠凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。
注意:制備過程中請戴好手套;梳齒處不可存在氣泡,液面應(yīng)保持平整無波紋。
開始跑膠
一、膠凝后取膠放到電泳槽中,倒入電泳液至浸過凝膠。
二、從冰箱中取出MARK和loading buffer,加入6ULloading buffer到樣品中混勻;然后用加樣槍分別加到凝膠的大孔中(要緩慢加,不要穿破凝膠,最后槍不要打盡以至于有空氣使樣品吹打出來);MARK加到小孔中的任一孔(記住位置)。
三、蓋上電泳槽,加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,電壓60-100V,樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動,電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低,當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳。
四、使用凝膠成像儀拍照,觀察條帶(mark或樣品是否有條帶顯示)。
觀察方法
電泳時間依據(jù)實驗的具體要求而定,在電泳中途可以使用紫外燈直接觀察,也可以根據(jù)指示劑確定條帶的遷移位置,各條區(qū)分開后電泳結(jié)束,取出凝膠直接檢測拍照。
拿到膠體條帶圖譜后,找到marker,根據(jù)marker就可以確定目標(biāo)條帶了。
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