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BIOHUB Polyethyleneimine PEI Pro (GMP) 聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)說明書

來源:上海起發生物科技有限公司   2023年08月23日 09:13  

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基本信息
    BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉染試劑,本制品利用BIOHUB公司生產的線性陽離子聚合物,按照符合GMP認證管理體系下,采用藥用規格原輔料生產,所用起始材料及所需化學品和配制過程均在無菌環境中操作進行,以確保制造過程中每個步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴格控制重金屬殘留、細菌內毒素殘留等,生產工藝符合 GMP 規范的產品生產與質量管理規程,保障生產過程及所有原輔料可追溯。
   
  • PH值檢測通過中國藥典 2020 版第四部 pH 值測定法(通則 0631)

  • 檢測遵循《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。

  • 檢測遵循USP Chapter<1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療,基因治療和組織工程產品中的輔料。

  • 細菌內毒素檢測符合中國藥典2015版四部通則(1143)方法2光度測試法(動態濁度法)

  • 重金屬殘留檢測符合國藥典 2020 版第四部重金屬檢查法(通則 0821)

  • 支原體檢測 使用支原體檢測試劑盒

質量信息表

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產品特點
BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數表達系統中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩定的高表 達(96 孔板至 100L 生物反應器)。現在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進行細胞轉染.。
  • GMP級別定制監管,支持并滿足合規要求。

  • 不含動物源性成分。

  • 嚴格遵循以下規范生產 1. ISO 9001:2015, certified facility。

  • 嚴格按照《GMP 附錄-細胞治療產品》國家藥品監督管理局。

  • 從工藝開發到臨床試驗和商業化的無縫過渡生產細胞系(HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產量。

操作方法參考

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一、貼壁細胞轉染 以 6 孔板轉染 293T 細胞為例:
(一)轉染前準備
1) 轉染前一天:用膠原酶 I型(78CL10002)消化細胞并計數(不建議用胰酶)。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養基和 1ml 的細胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養 箱培養 24h。
2) 24h 后,移除之前培養基,每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意:確保 293T 細胞生長狀態良好傳代 不超過 15 代。
(二)轉染過程
3) 第一天:顯微鏡下檢查細胞匯合度, 當細胞達到 70%到 80%的匯合度時,開始準備轉染。
4) 對于每孔細胞,用 100µl 無血清培養基(如 OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml(DNA/總培養體積)。
5) 對于每孔細胞,用 100μL 無血清培養基(如 OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP 的比例要依據自己實驗摸索最適比例。
6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中(總體積 200µL)輕輕混勻, 室溫孵育 30 分鐘。
7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP復合物滴加到細胞培養板每個孔中,輕輕搖動培養板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入,而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。
8) 將培養板放入 37°C,5%CO2培養箱培養中培養 24h。
(三)觀察轉染結果 9) 第二天:在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率,通常超過 80%的 293T 細胞在轉染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉染時應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進行優化,以達到最適比例, 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI,用BIOHUB-PRO  GMP時應適當 降低使用濃度。
     通常情況下,分別準備BIOHUB-PRO GMP GMP和 DNA 轉染溶液時其體積一般是轉染前每孔細胞培 養液體積總量的 1/10-1/20,如細胞培養液體積為 3ml,則稀釋BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的體積為150ul。質粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml(DNA 質量/細胞培養總體積)[1][4]。 不同質粒種類以及大小會影響轉染效率,如較大片段插入質粒可能轉染效率低,可根據 實際實驗需要調整,如適當增加轉染質粒總量等。 ?HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打,但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞,如果表達的是膜蛋白,胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達, 建議用膠原酶消化細胞,我們推薦用(78CL10002)的膠原酶。 對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例,就可以在轉染后 24 至 96 小時內多次觀察轉染效率,以優化最大表達量時間點。
二、懸浮細胞轉染 離心對數期生長的細胞用新鮮的培養基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規模轉 染時,如需大規模轉染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL。以 293F 細胞 于 100mL 培養瓶(溶液體積占瓶體積的 1/5)操作體系舉例如下:
(一)轉染前準備
1) HEK293F 細胞傳代接種于 20mL 懸浮細胞生長培養基中(36.5℃,120rpm,5%CO2 )的條 件下培養。當細胞密度到 1X10 6cells/mL,然后旋緊瓶口放入搖床繼續培養,2~4 小時 后可以進行轉染。
(二)轉染過程
2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無血清培養基)稀釋適量的 DNA,使 DNA 終濃度為 1ug/ml(DNA/總 培養體積)。混勻并靜置 5min。
3) 用1mlOptiPRO™SFM(無血清培養基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO  GMP,混勻并靜置 10min。
(78BioPEI:DNA 參考比例范圍,可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO  GMP和 DNA 優化方案優化)。
4) 將BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。
5) 將BIOHUB-PRO  GMP轉染復合物逐滴加入到細胞培養液中,搖勻后旋緊瓶口放回搖床 (36.5℃,5%CO2,120rpm)。
6) 基因表達可在 24-72 小時后檢測,具體時間取決于細胞系和轉基因.
小貼士:在懸浮培養中,單個細胞的轉染效率要高于聚集在一起的細胞,需要優化適合單細胞的 生長條件。 方形瓶應經過兩個連續的干燥循環高壓滅菌(每個 45 分鐘,干燥 15 分鐘) 蓋子應盡可能松,不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前,將其wan全放入層流罩中。如 果瓶子向內塌陷,細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產量,有參考文獻表明轉染后 24 小時,可以適當稀釋細胞,稀 釋比例參考范圍(1:2—1:5)之間,可以增加蛋白產量,稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據經驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 轉染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉染,但必須經過上述 特定流程的 DNA 和轉染試劑的比例和用量的相應優化。



注意事項

  1. 不同質粒種類以及大小會影響轉染效率,可如較大片段插入質粒可能轉染效率低,可根據實際實驗需要調整,如適當增加轉染質粒總量等。

  2. 細胞狀態及代數會較大程度影響轉染。剛復蘇細胞需傳代2-3次以上,待細胞生長穩定后做轉染實驗。為保證實驗穩定性,轉染細胞盡量選擇20代以內進行實驗。

  3. 對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。

  4. 初次使用應優化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉染效率。 DNA 和轉染試劑的比例, 通常推薦是1:2-1:3,通過調整DNA/BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑比例優化轉染效率,調整范圍DNA(μg):BIOHUB-PRO  GMP(μL) 比值在1:0.5-1:5。

  5. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。



貨號品名規格品牌
78EF10003-5mlBIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)5mlBIOHUB
78EF10003-1LBIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)1LBIOHUB








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