木瓜蛋白酶(Papain),又稱木瓜酶,是一種蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜(Carieapapaya)中含有的一種低特異性蛋白水解酶,廣泛地存在于番木瓜的根、莖、葉和果實內(nèi),其中在未成熟的乳汁中含量。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸,屬于巰基蛋白酶,它具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點。
化學(xué)性質(zhì)
木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末,微有吸濕性;木瓜蛋白酶溶于水和甘油,水溶液為無色或淡黃色,有時呈乳白色;幾乎不溶于乙醇、氯/仿等有機溶劑。木瓜蛋白酶是一種含巰基(-SH)肽鏈內(nèi)切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,有較廣泛的特異性,對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力,但幾乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的PH值6~7(一般3~9.5皆可),在中性或偏酸性時亦有作用,等電點(pI)為8.75;木瓜蛋白酶溫度55~65℃(一般10~85℃皆可),耐熱性強,在90℃時也不會失活;受氧化劑抑制,還原性物質(zhì)激活。
催化機制
木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機制包括:在His-159作用下Cys-25去質(zhì)子化,而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環(huán)的擺放,使得去質(zhì)子化可以發(fā)生;然后Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳,并與之共價連接形成酰基-酶中間體;接著酶與一個水分子作用,發(fā)生去酰基化,并釋放肽鏈的羰基末端。
酶活測定
基本原理
木瓜蛋白酶能使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(底物)水解而釋出N-苯甲酰-L-精氨酸,其釋出量可用氫氧化/鈉液滴定,以此確定酶活力。
酶活單位
在25℃下,每分鐘內(nèi)能催化分解1umol底物的酶量,稱為1單位。
試液制備
1、底物溶液:準(zhǔn)確稱取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽1.42g,加10mmol/LEDTA、50mmol/L半胱氨酸液2.6mL,加適量水,用0.1mol/L氫氧化/鈉液調(diào)節(jié)pH至6.2,最后定容至50.0mL。
2、待測酶液:取試樣用水稀釋至適當(dāng)濃度,并調(diào)節(jié)至pH6.2。
測定方法
25℃恒溫條件下,取25mL燒杯裝在pH自動滴定儀上,加底物溶液3.75mL、3mol/L氯化鈉溶液2.50mL、重蒸餾水1.25mL,混合后加入待測酶液后立即計時,用0.1mol/L氫氧化/鈉在電磁攪拌下連續(xù)滴定以保持pH6.2,記下每分鐘所耗0.01mol/L氫氧化/鈉毫升數(shù)。同時進(jìn)行空白校正。按下式計算木瓜蛋白酶的活力P(單位/mg):
P =C·ΔV·1000/W
式中:c:氫氧化/鈉液的濃度,mol/L;ΔV:每分鐘消耗氫氧化/鈉液的體積減去空白值;W:反應(yīng)液中木瓜蛋白酶的質(zhì)量,mg。
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