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疏水色譜柱是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動相洗脫時，各組分遷移速度不同而達到分離的目的。流動相一般為pH 6-8的鹽水溶液，具有對蛋白質的回收率高，蛋白質變性可能性小等優勢。由于流動相中不使用有機溶劑，也有利于蛋白質保持固有的活性。
不同于反相色譜，在疏水反應色譜中上述官能團的密度較低，且蛋白分子只在一個或少數幾個位置上吸附。
鹽濃度較高時會產生吸附作用，但若加入低百分比濃度的有機溶劑降低鹽濃度，則會產生脫附作用。
盡管二者均以疏水作用為基礎，但HIC分離的選擇性明顯不同于反相LC。
相對于RPC，HIC的最高容量較低，但其優勢在于：流動相條件（主要是含水流動相）通常不會破壞高階蛋白質結構。
TSKgel Phenyl-5PW疏水色譜柱（HIC）能夠有效分離抗體的結構同分異構體。在抗體藥物中，對于一些由于等電點相同而無法通過離子交換色譜法實現分離的，但表面疏水性有差異的結構同分異構體、或多聚體，可以考慮使用疏水色譜法來進行分析。并且疏水色譜法也可以用于抗體降解產物的分析。
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