細胞骨架（肌動蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

  細胞骨架（肌動蛋白單體；G-ACTIN）紅色熒光染色試劑是一種旨在使用ALEXA染料標記的DNA酶I，探尋細胞骨架的肌動蛋白單體的分布和局部定向變化狀況的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細胞（動物、人體、植物等）的細胞骨架裝配的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

肌動蛋白（actin）是42KD的球蛋白，構成細胞骨架的微絲（microfilament）和肌肉收縮裝置的細肌絲（thin filament），以及細胞膜表面偽足（pseudopodia）和微絨毛（microvilli）。肌動蛋白存在于所有真核生物細胞中，且高度進化保留，參與各種重要細胞功能，包括細胞遷移、細胞分裂、肌肉收縮、細胞形態維護、膜轉運（membrane trafficking） 等。哺乳動物具有六種異構體，分成α、β、γ三類。球狀肌動蛋白（G-actin）在生理條件下，組合成長絲聚合體，轉化為絲狀肌動蛋白（F-actin），形成細胞骨架的微絲。肌動蛋白的聚合與解聚的動態學變化是細胞骨架裝配（cytoskeleton assembly）的主要參數之一。牛胰腺DNA酶I（DNase I）具有與肌動蛋白單體（G-actin）高度親和力結合的特征，因此通過ALEXA染料標記的DNA酶I可以體外探測細胞G-肌動蛋白的分布和含量，據此分析細胞骨架裝配的調控機制。

產品內容

  清理液（Reagent A）               毫升

  固著液（Reagent B）               毫升

  通透液（Reagent C）               毫升

  染色液（Reagent D）             微升

  復染液（Reagent E）              微升

產品說明書             1份

保存方式

保存  染色液（Reagent D）和  復染液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

熒光（共聚焦）顯微鏡：用于細胞熒光觀察

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下凍融。移取xx微升  通透液（Reagent C）到1.5毫升離心管，然后分別加入xx微升  染色液（Reagent D）和  復染液（Reagent E），混勻后，標記為  染色工作液，置于冰槽里，放進暗室里備用。然后進行下列操作。

一、 直接法

1． 準備1個細胞培養6孔板，內置1個細胞1 X 1 cm大小的載玻片

2． 接種待測細胞培養，直至每孔鋪滿率達70％

3． 小心抽去細胞培養液

4． 輕輕加上xx微升  清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

5． 小心抽去  清理液（Reagent A）

6． 輕輕加上xx微升  固著液（Reagent B）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

7． 室溫下孵育15分鐘

8． 小心抽去  固著液（Reagent B）

9． 輕輕加上xx微升  通透液（Reagent C）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

10． 室溫下孵育5分鐘

11． 小心抽去  通透液（Reagent C）

12． 輕輕加上xx微升  清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

13． 小心抽去  清理液（Reagent A）

14． 重復實驗步驟12和13二次

15． 小心加上xx微升  染色工作液， 覆蓋樣品表面

16． 在暗室里室溫下孵育20分鐘

17． 小心抽去  染色工作液

18． 輕輕加上xx微升  清理液（Reagent A）到細胞載玻片上，覆蓋樣品表面

19． 小心抽去  清理液（Reagent A）

20． 封片

21． 即刻在熒光（共聚焦）顯微鏡下進行觀察（每個視野計數200個細胞）：激發波長590nm，散發波長617nm（G-肌動蛋白染色）或激發波長350nm，散發波長460nm（細胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環或橢圓狀

二、 間接法

1． 準備1個25cm²細胞培養瓶的待測細胞，直至鋪滿率達70％（約100萬細胞數）

2． 小心移出細胞培養液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）

3． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋細胞表面

4． 小心移出xx毫升  清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管 

5． 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細胞表面

6． 放進37℃培養箱孵育1分種

7． 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落

8． 加入3毫升用戶自備的*細胞培養液

9． 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞可以由此步開始）

10． 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

11． 小心抽去上清液

12． 加入xx微升  清理液（Reagent A），混勻

13． 轉入到1.5毫升離心管

14． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升  固著液（Reagent B），混勻

17． 室溫下孵育15分鐘

18． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

19． 小心抽去上清液

20． 加入xx微升  通透液（Reagent C），混勻

21． 室溫下孵育5分鐘

22． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

23． 小心抽去上清液

24． 加入xx微升  清理液（Reagent A），混勻

25． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

26． 小心抽去上清液

27． 重復實驗步驟24至26二次

28． 加入xx微升  染色工作液

29． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群

30． 在暗室里室溫下孵育20分鐘 

31． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

32． 小心抽去上清液

33． 加入xx微升  清理液（Reagent A），混勻

34． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）

35． 小心抽去上清液

36． 加入xx微升  清理液（Reagent A），混勻

37． 即刻移取10微升在載玻片上壓片

38． 在熒光（共聚焦）顯微鏡下進行觀察（每個視野計數200個細胞）：激發波長590nm，散發波長617nm（G-肌動蛋白染色）或激發波長350nm，散發波長460nm（細胞核染色）――

紅色熒光顯示G-肌動蛋白；藍色熒光顯示細胞核為圓環或橢圓狀

注意事項

1． 本產品為10次操作

2． 在整個操作過程中須戴手套，以防污染

3． 孵育時，必須避免光照

4． 建議檢測細胞量達10⁶細胞數為佳

5． 用戶可以根據情況，適度調整試劑用量

6． 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光分析，不宜超過1小時 

7． 本公司提供系列細胞骨架檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定熒光清晰