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內毒素專題|內毒素檢測總出現假陰性?掌握這些才能應萬變

來源:上海瑋馳儀器有限公司   2023年05月25日 16:15  

在生物制品、醫療器械等產品的整個生產階段,無論是原輔料、過程產品的過程檢測還是終產品的放行檢測中,細菌內毒素檢測(BET)都是需要的環節,如果內毒素檢測出現假陰性,那么有潛在內毒素的產品有可能被放行到市場中,引起發熱、休克甚至更重大的事故。







小伙伴們是不是也經常被假陰性折磨呢,本期小編帶你了解如何應對BET假陰性!


什么是假陰性

對于凝膠法,當供試品內毒素濃度≥2倍檢測試劑的靈敏度,但檢測結果仍為陰性,則說明BET假陰性。對于光度法,若內毒素的回收率<50%,則說明在此試驗條件下供試品溶液存在抑制干擾,導致內毒素檢測不出來。



造成假陰性的干擾因素及解決方案



供試品的干擾

  • pH值

BET機理是酶促反應,而酶的反應條件相對來講比較嚴苛,因此要求供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范圍內,過高或過低的pH都會抑制反應,出現假陽性。


若不在6.0~8.0范圍,建議使用廠家提供的緩沖Buffer稀釋調節,如Tris Buffer。







  • 二價陽離子

內毒素激活鱟試劑中的酶需要二價陽離子,如Mg2+的參與,若供試樣品中存在的肝素或EDTA等成分螯合陽離子,二價陽離子濃度不足時,便抑制反應,導致假陰性的出現。為了克服金屬離子螯合劑的抑制干擾,可用MgCl2稀釋供試品。


與Mg2+不同,Ca2+不會激活BET反應,而是具有非常強烈的抑制作用,因此存在Ca2+的供試品可用LRW稀釋。







  • 高滲透壓

過高濃度的鹽或糖溶液會脫去蛋白質中的水分子,使蛋白質變性,出現抑制干擾。可通過稀釋供試品去除干擾。


  • 酶抑制劑

人血漿中的絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制內毒素激活鱟試劑。可用LRW稀釋10倍,再70±2℃加熱10 min破壞抑制劑,進而去除干擾。


  • 屏蔽內毒素

血漿蛋白組分、電解質溶液和脂質乳劑等有結合內毒素的特性,如脂質乳劑的兩親性對疏水的內毒素具有親和力,脂類包裹內毒素,使內毒素無法暴露出來,實驗結果將出現假陰性。可通過添加分散劑的方式去除抑制干擾。







操作(包括操作環境)

  • 操作

鱟試劑與細菌內毒素反應后形成的凝膠比較脆弱,容易受到震動等劇烈操作而變形,將檢測結果誤判為陰性。


因此對于凝膠法,在溫育過程和取放反應管時一定要輕柔操作,避免安瓶或試管左右晃動,且在保溫過程中不可隨時取出觀察。


  • 反應溫度

鱟試劑的靈敏度對溫度較敏感,反應溫度在25~40℃之間,一般設置37°C ± 1°C。溫度過高,會破壞鱟試劑,從而達不到檢測目的。


實驗耗材、器具

  • 檢測器具

在稀釋標準品等操作過程中要用到一些器具,建議選擇玻璃器材,非塑料制品,因為塑料制品容易吸附內毒素,造成BET反應內毒素不足。







  • 表面活性劑

高濃度表面活性劑會使鱟試劑中的蛋白質變性,形成抑制。因此所用器具在用洗滌劑清洗后要沖洗干凈并滅菌,供試品溶液可通過LRW稀釋來降低干擾。



細菌內毒素檢測試劑怎么選






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