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 冰凍切片NADH心肌黃酶（NADH-TR）活性染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 冰凍切片NADH心肌黃酶（NADH-TR）活性染色試劑是一種旨在使用人工電子受體染料硝基藍四氮唑（NBT），受到NADH心肌黃酶催化還原，產生不溶性紫藍色色素沉淀，來分析冰凍組織樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心改良傳統方法、成功實驗證明的。主要適用于動物肌肉組織細胞的心肌黃酶活性定性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

心肌黃酶（Diaphorase），又稱為硫辛酰胺脫氫酶（lipoamide dehydrogenase），黃遞酶，二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氫硫辛酸脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期從豬心肌中提取，產品又呈現熒光的黃綠色蛋白質，故被稱為心肌黃酶。分子量102000至110000。NADH心肌黃酶直接和黃素蛋白（Flavoprotein）反應，釋放出氫原子，將氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）還原為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），傳遞氫原子給氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作為電子供體，還原人工電子受體，例如染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），產生不溶性甲暨色素，由此用于鑒別動物肌肉組織類型。

產品內容

 清理液（Reagent A）           毫升

 染色液（Reagent B）           毫升

 反應液（Reagent C）           毫升

 透亮液A（Reagent D）          毫升

 透亮液B（Reagent E）          毫升

 透亮液C（Reagent F）          毫升

產品說明書              1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）和 反應液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 透亮液（Reagent D）具有揮發性，注意密閉瓶蓋；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養箱：用于反應孵育

中性樹脂：用于切片封片

光學顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實驗步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取xx微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 反應液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。

1． 取出待測的10微米厚的冰凍組織切片 

2． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個樣品表面

3． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

4． 小心加上xx微升  染色工作液，鋪滿整個切片樣品表面

5． 放進37℃培養箱里孵育30分鐘，避免光照

6． 小心移去切片上的 染色工作液

7． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

8． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

9． 重復實驗步驟6至8二次

10． 小心加上xx微升 透亮液A（Reagent D）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

11． 室溫下孵育5分鐘（注意：根據退色程度，調整孵育時間）

12． 小心移去切片上的 透亮液A（Reagent D）

13． 小心加上xx微升 透亮液B（Reagent E）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

14． 室溫下孵育5分鐘（注意：根據退色程度，調整孵育時間）

15． 小心移去切片上的 透亮液B（Reagent E）

16． 小心加上xx微升 透亮液C（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

17． 室溫下孵育5分鐘（注意：根據退色程度，調整孵育時間）

18． 小心移去切片上的 透亮液C（Reagent F）

19． 小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

20． 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）

21． 重復實驗步驟19至20二次

22． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）

23． 即刻在光學顯微鏡下觀察和計數：

表達NADH心肌黃酶的組織細胞為陽性組織細胞

呈現深紫藍色為I型肌纖維

淺紫藍色為II型肌纖維

注意事項

1． 本產品為50次操作

2． 操作時，須戴手套

3．  反應液（Reagent C）避免反復凍融

4． 陰性對照時， 染色工作液不含有 反應液（Reagent C）

5． 心肌組織可以用于陽性對照

6． 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干

7． 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面

8． 整個操作，在避光狀態下進行

9． 染色孵育時間，根據樣品和酶活性強弱調整，通常為5至60分鐘

10． 使用 透亮液A、B、C時，注意觀察去色變化，切莫過度退色

11． 透明+封片處理后，可以強化染色

12． 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察

13． 樣品染色后保存，避免光照

14． 染色參考圖像見下圖

15． 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定顯色清晰