Q：我想要進(jìn)行多色實(shí)驗(yàn)，對(duì)于我的樣本有什么要求嗎？

A：您按照免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)您的樣本進(jìn)行前處理即可。如果是從歷史切片或者蠟塊中挑選用來做多色，請(qǐng)盡量選取相對(duì)較新的樣本（一個(gè)月內(nèi)），最長(zhǎng)不要選保存超過半年的樣本，可能會(huì)有靶點(diǎn)缺失或者強(qiáng)非特異性，導(dǎo)致染色效果欠佳。

附上石蠟切片樣本處理推薦：

• 取新鮮組織（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的組織過大，需要切小后再做固定，以免組織太厚固定液滲透不良，導(dǎo)致后續(xù)染色效果不佳

• 組織離體后（不要超過30分鐘）迅速轉(zhuǎn)移到固定液中（一般選用10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛），在常溫條件下固定時(shí)間為18-24小時(shí)，不要固定太長(zhǎng)時(shí)間，容易導(dǎo)致組織抗原丟失，影響陽(yáng)性信號(hào)顯色。

• 浸蠟溫度應(yīng)控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細(xì)胞收縮，容易導(dǎo)致后續(xù)染色過程中組織脫片。

• 切片厚度最佳為4微米，組織太厚容易導(dǎo)致染料滲透不加，且多層細(xì)胞之間熒光發(fā)生串?dāng)_，影響成像觀察。貼片需選用免疫組化專用的防脫載玻片，不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，撈片后豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴，不要用紙擦拭玻片。

• 切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右，到干片為止，否則后續(xù)染色過程中易脫片。但需要注意溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)均會(huì)影響抗原的活性，因?yàn)樵诟邷馗稍飾l件下會(huì)加速組織切片中抗原的氧化。

Q：如果我的樣本是冰凍切片或者細(xì)胞爬片，可以用來做多色實(shí)驗(yàn)嗎？

A：可以的，多色實(shí)驗(yàn)本身不局限您的樣本類型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否經(jīng)得起多輪抗體洗脫，在樣本不脫片的情況下，才能有一個(gè)比較好的染色效果。如果您是這類樣本，您需要額外準(zhǔn)備一瓶抗體洗脫液（abs994），替代多色實(shí)驗(yàn)中的熱修復(fù)步驟，采用溫和的洗脫方式，避免高溫高壓破壞切片。需要注意的是，您依舊需要控制切片厚度，盡量保證在單層細(xì)胞的厚度，如太厚，多層細(xì)胞之間發(fā)生重疊，熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生串?dāng)_。

（PS：石蠟切片是適合做多色實(shí)驗(yàn)的樣本類型！）

Q：我該如何選擇用于做多色的抗體呢？

A：多色這項(xiàng)技術(shù)突出的一個(gè)優(yōu)勢(shì)就在于對(duì)一抗種屬?zèng)]有特殊的限定，根據(jù)樣本種屬選擇即可，我們?cè)噭┖斜旧砼鋫淞硕梗ㄊ笸猛ㄓ枚够蛘呖雇枚梗谶x取一抗來源的時(shí)候，盡可能選擇兔子或者小鼠來源的一抗，如確實(shí)找不到鼠或兔來源的一抗也沒有關(guān)系，您只需要再準(zhǔn)備一個(gè)跟該一抗來源適配的能用于免疫組化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能應(yīng)用于IHC，并且盡量選擇單克隆抗體，多抗往往容易產(chǎn)生非特異性。

Q：我注意到你們多色試劑盒中也是熒光染料，我在操作過程中需要額外避光嗎？

A：不用的，您在常規(guī)日光燈環(huán)境下操作就可以，我們?nèi)玖系臒晒鈴?qiáng)度很高，不會(huì)那么容易淬滅，但涉及到需要孵育或者保存的時(shí)候還是建議您采用避光濕盒進(jìn)行。

Q：我今天做好了多色片子，但無法立即進(jìn)行掃描觀察，我該怎么保存呢？

A：染好的多色片子可以避光在4℃條件下保存較長(zhǎng)的時(shí)間，但我們建議您完成染色以后，在兩周內(nèi)完成成像，并且如果需要長(zhǎng)時(shí)間保存，建議您用透明指甲油對(duì)蓋玻片邊緣進(jìn)行密封。如保存時(shí)間過長(zhǎng)，或保存不當(dāng)，封片劑容易干掉，此時(shí)再成像會(huì)有較強(qiáng)非特異性，可以使用PBS把蓋玻片洗下來，重新封片以后再觀察，但成像效果依舊會(huì)打折扣，還是建議您盡快完成成像。

（PS：雖然熒光染料沒有那么容易淬滅，但若多次成像反復(fù)激發(fā)，依舊會(huì)淬滅，2-3次影響不會(huì)很大，但不排除偶然性哦）

Q：整個(gè)多色實(shí)驗(yàn)一般需要多久能夠完成呀？一天能行嗎？

A：如果您的指標(biāo)比較少（2~3個(gè)指標(biāo)），恰好您又是“肝帝”愿意熬夜做實(shí)驗(yàn)，那么一天是可以做完的哦，因?yàn)槲覀兌嗌玖嫌行盘?hào)放大的功能，且試劑盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信號(hào)，因此原本需要4℃過夜的一抗孵育，可以在室溫1小時(shí)，或者37℃烘箱一小時(shí)完成，滿打滿算一天是可以做完實(shí)驗(yàn)的。但如果您不想要這么“肝”，當(dāng)然可以，您只需要在一抗孵育的步驟選擇4℃過夜，第二天再來繼續(xù)做二抗孵育等后續(xù)操作就行，跟您做IHC實(shí)驗(yàn)一樣，當(dāng)您指標(biāo)比較多的時(shí)候，可以合理安排，部分抗體室溫1小時(shí)，部分抗體4℃過夜，但也不可把“戰(zhàn)線”拉得太長(zhǎng)，控制在盡可能短的時(shí)間完成實(shí)驗(yàn)，畢竟遲則生變哦。

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