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實時熒光定量PCR的定量原理

來源:北京羅赫商貿(mào)有限公司   2023年05月15日 13:39  
實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針,當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號,從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。
 
實時熒光定量PCR是利用熒光信號的變化,實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。
 
1.擴增曲線
 
在實時熒光定量PCR進程中,通過熒光定量PCR儀,在PCR每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集,以熒光強度為縱軸,循環(huán)次數(shù)為橫軸,所得到的曲線稱為PCR的擴增曲線。
 
2.熒光閾值
 
實時熒光定量PCR的前面十多個循環(huán),熒光強度變化不大,熒光強度的平均值可稱為基線值,在基線值的基礎(chǔ)上,增加一定數(shù)量后得到一熒光值,這一點后,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,熒光強度明顯增強,因此稱該值為熒光閾值。一般取PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。
 
3.Ct值與標準曲線
 
Ct值是指PCR擴增過程中,擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn),Ct值與反應(yīng)管內(nèi)的模板數(shù)密切相關(guān),起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。

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