細胞鉀離子（potassium ion）濃度熒光定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細胞鉀離子（potassium ion）濃度熒光定量檢測試劑盒是一種旨在通過鉀離子敏感性熒光探針PBFI，與鉀離子結合后，其熒光強度顯著增強，在熒光分光光度儀下觀察相對熒光峰值的變化，來測定樣品中總鉀離子濃度的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體細胞裂解懸液樣品中總鉀離子的濃度檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。

技術背景

鉀離子（potassium ion；K）是人體中的一種重要電介質和礦物質，尤其是細胞內和細胞外基質中的重要陽離子。其功能在于維持細胞內外的酸堿平衡、滲透壓、膜電位、神經肌肉功能等。血鉀增高，即高血鉀癥（hyperkalemia）與腎衰、脫水性休克、腎上腺皮質功能不全有關；而血鉀降低，即低鉀血癥（hypokalemia）與營養不良、負氮平衡、胃腸道液體流失等有關。正常人體的血鉀濃度范圍狹窄，在3至6毫摩爾。鉀的檢測包括化學沉淀法、離子選擇性電位分析法（ion selective potentiometry；ISP）、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到其它金屬元素的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鉀結合性苯并呋喃間苯二甲酸（potassium binding benzofuran isophthalate；PBFI），是苯并呋喃間苯二甲酸衍生物，其熒光基團與重氮冠醚（diazocrown ether）的氮分子鏈接，產生相應配體的選擇性，一旦與鉀離子結合，其熒光強度迅速增強，可以敏感測定游離鉀離子水平。在熒光分光光度儀下，激發波長340至380nm，散發波長450至550nm，來定量測定的鉀離子濃度。

產品內容

  清理液（Reagent A）            毫升

  裂解液（Reagent B）            毫升

  反應液（Reagent C）            毫升

  飽和液（Reagent D）            毫升

  陰性液（Reagent E）            毫升

產品說明書               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；  反應液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

黑色96孔板：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標儀：用于樣品熒光分析

實驗步驟

一、 樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx  清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1． 準備好待測樣品，例如細胞裂解懸液等，置于冰槽里備用

2． 設定好熒光酶標儀（25℃）：激發波長345nm，散發波長510nm

三、熒光測定

1． 準備1個黑色96孔板，標記為：樣品孔、空白對照孔、最大對照空

2． 移取100微升（20微克蛋白）樣品到樣品孔里

3． 移取xx  飽和液（Reagent D）到最大對照空里

4． 移取xx  陰性液（Reagent E）到空白對照空

5． 分別加入xx  反應液（Reagent C）到所有孔里

6． 輕輕搖動黑色96孔板，混勻

7． 室溫下（25℃），孵育30分鐘，避免光照

8． 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 

9． 計算樣品鉀離子濃度（注意：不要遺忘乘上稀釋倍數）

注意事項

1． 本產品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 孵育反應完成后即刻進行熒光測定

4． 用戶可以選擇激發波長340至380nm，散發波長450至550nm的任一波長進行檢測

5． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

6． 樣品濃度可以按照細胞數或蛋白量定義

7． 本公司提供系列鉀生化檢測試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感