1. 重組慢病毒的制備

Day1: 匯合度90%的10cm dishs HEK293T細(xì)胞（~ 6×107/dish）按1：1比例傳代至15cm dishs，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)到90%-95%（~ 1.5×108/dish），培養(yǎng)基為Gibico高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）。

Day2: 轉(zhuǎn)染前2-3個(gè)小時(shí)更換培養(yǎng)基（含10%FBS)；

2)按照以下比例配制轉(zhuǎn)染試劑：

Mix 1體積μlMix 2量DMEM（無(wú)FBS）1000μlDMEM（無(wú)FBS）1000μl目的基因質(zhì)粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μg

Mix 1和Mix 2分別混合后，室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合，室溫30min，加入至15cm dish中。（細(xì)胞達(dá)到匯合度90%，細(xì)胞過(guò)少會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率）

Day3: 6h-24h內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)基（含10%FBS），觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照。

Day5: 72h觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。收取上清培養(yǎng)基，過(guò)0.45μm濾膜，上清培養(yǎng)基加入超速離心管中，配平后離心，25000rpm，4℃離心1.5h。棄上清，用適當(dāng)病毒保存液回溶混勻溶解過(guò)夜。

Day6：收集病毒分裝，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。

2. 重組慢病毒滴度測(cè)定

2.1 整合數(shù)法標(biāo)定不帶熒光的重組慢病毒滴度

2.1.1 病毒感染細(xì)胞

①感染前6 h 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔 均勻接種HEK293細(xì)胞。

②將慢病毒進(jìn)行梯度稀釋，共做3個(gè)梯度，即每孔（500μl 無(wú)雙抗、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒，振蕩混勻后加至接種好細(xì)胞的24孔板中，加病毒之前將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸凈。

③感染 18-20h 后，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM完培。

④感染 64-68h 后收集細(xì)胞并進(jìn)行基因組DNA的提取。

⑤測(cè)定時(shí)，設(shè)置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對(duì)照，以校驗(yàn)檢測(cè)出的數(shù)值。

2.1.2 提取基因組DNA（按照AxyGEN 的基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作）

2.1.3 qPCR檢測(cè)

① 以被測(cè)慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，慢病毒載體上的通用引物進(jìn)行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù)。

② 以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，Actin引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。

③ qPCR

qPCR反應(yīng)體系如下：

組成成分體積2 × SYBR Green mix10 μlPrimers (Forward & Reverse mixture)0.8 μl超純水（DNase & RNase Free）7.2μl模板2μlTotal20μl

qPCR反應(yīng)程序：

循環(huán)參數(shù)預(yù)變性95℃ 3min；95℃ 5S；60℃ 15S；72℃ 15S+Plate Read39個(gè)循環(huán)

2.1.4 計(jì)算慢病毒IU（Integration Unit）/ml

IU/ml=(C×N×D×1000)/V

注：C=平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù)D=病毒的稀釋倍數(shù)N=感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目（約為2.5×10E5）V=加入稀釋病毒的體積數(shù)

2.2 孔稀釋法標(biāo)定帶熒光的重組慢病毒滴度

Day1: 細(xì)胞的準(zhǔn)備

在96孔板中的每個(gè)孔中接種1-4×104個(gè) HEK293細(xì)胞。

Day2: 病毒的稀釋與感染

在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋，分別是1~10-6梯度。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，注意是兩個(gè)重復(fù)，并做好標(biāo)記。

Day5: 熒光計(jì)數(shù)與滴度計(jì)算

感染72h后，用熒光顯微鏡對(duì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)出最后兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算2個(gè)重復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)，假設(shè)為A（倒數(shù)第二孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）和B（倒數(shù)第一孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）。

慢病毒滴度計(jì)算公式：病毒滴度 (TU/ml) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μl）

3. 慢病毒的使用

3.1 重組慢病毒體外感染細(xì)胞

不同的細(xì)胞所使用的病毒MOI值會(huì)有所不同。建議在正式實(shí)驗(yàn)前，在目的細(xì)胞中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳MOI值。

3.1.1 慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)

為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。操作步驟如下：

①Day1 細(xì)胞的準(zhǔn)備

將目的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞融合率為50%為最佳。為保證細(xì)胞生長(zhǎng)良好，請(qǐng)保證細(xì)胞貼壁過(guò)夜。

②Day2 病毒的稀釋

取10μL慢病毒原液加入90μL培養(yǎng)液中做1:10稀釋（10-1），以此為起點(diǎn)做梯度稀釋直至稀釋10-7。可根據(jù)實(shí)際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

③Day2 感染目的細(xì)胞

取出提前準(zhǔn)備好的96孔板，用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)液，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對(duì)照組。

④第Day2~Day10 觀察熒光或檢測(cè)

慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染較慢，請(qǐng)?jiān)诟腥炯?xì)胞后48、72、96、120小時(shí)分別觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況（如果您選擇的產(chǎn)品不帶有熒光標(biāo)簽，請(qǐng)?jiān)?/span>48、72、96、120小時(shí)分別收獲細(xì)胞并通過(guò) Western-Blot 或其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)）。

注意：由于不同細(xì)胞對(duì)慢病毒感染過(guò)程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，請(qǐng)于12-24小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)以確認(rèn)加入的病毒量是否合適。

3.1.2 慢病毒感染目的細(xì)胞

進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)可使用完培（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋。培養(yǎng)液中的血清、雙抗或其他營(yíng)養(yǎng)因子不會(huì)影響慢病毒的感染效率。

以24 孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行HEK293細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

注意：實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)按照不同的MOI 設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI 和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量。

最適病毒用量的計(jì)算公式：病毒用量TU=最佳MOI×細(xì)胞數(shù)目/病毒滴度

例如, 如果您目的細(xì)胞的最佳MOI=10，您需要感染106的細(xì)胞，那么您共計(jì)需要107 TU的病毒. 如果病毒滴度為1×108 TU/mL, 那么您實(shí)驗(yàn)需要的病毒量就是100μL.

① Day1 細(xì)胞的準(zhǔn)備

在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個(gè)孔內(nèi)接種3-5×104個(gè)HEK 293細(xì)胞，鋪板時(shí)細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)液體積為300μL，進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的匯合度約為70%。

②Day2 病毒的準(zhǔn)備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況和MOI 值，用培養(yǎng)液準(zhǔn)確稀釋慢病毒原液。

注意：可使用PBS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋病毒原液。

③Day2 感染目的細(xì)胞

在目的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液， 混勻后放于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）孵育過(guò)夜。

注意：1）感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對(duì)最終的感染效果高低影響很大，請(qǐng)務(wù)必保證加入病毒前，細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2）若慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率較低，可通過(guò)提高MOI 值提高病毒的感染效率，也可在培養(yǎng)液中加入維真生物助感染試劑ADV-HR來(lái)提高病毒的感染效率。

④Day3 更換培養(yǎng)液

病毒感染細(xì)胞24小時(shí)后，更換培養(yǎng)液。

注意：換液具體時(shí)間需視細(xì)胞狀態(tài)而定。如果慢病毒對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，最短可于加病毒4小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。

⑤Day6 感染效率檢測(cè)

在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計(jì)算慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。如選擇的慢病毒載體不帶有熒光標(biāo)記，可以通過(guò)Q-PCR(定量PCR)檢測(cè)目的基因的表達(dá)來(lái)評(píng)估感染效率。

注意：1）慢病毒表達(dá)較慢，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長(zhǎng)，建議感染96小時(shí)后觀察熒光的表達(dá)。

2）感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過(guò)觀察熒光表達(dá)的時(shí)間和強(qiáng)度來(lái)確定慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染情況。

3）感染期間，請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的情況及時(shí)換液，以保證細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

蘇州阿爾法生物提供細(xì)胞培養(yǎng)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、細(xì)胞培養(yǎng)耗材、細(xì)胞株、基因編輯細(xì)胞株、所提供的CRISPR-Cas9表達(dá)病毒具有以下特點(diǎn)：
1、病毒產(chǎn)品現(xiàn)貨提供；
2、可以滿足不同細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)的需求；
3、攜帶抗性用于穩(wěn)轉(zhuǎn)構(gòu)建；

4、表達(dá)穩(wěn)定適合用于基因敲除；

更多內(nèi)容進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行了解。