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PCR系列?鳥類多瘤病毒(APV)核酸檢測試劑盒

來源:上海茁彩生物科技有限公司   2023年04月11日 10:52  

本試劑盒根據鳥類多瘤病毒(Avian Polyoma Virus,APV)基因中的保守區設計引物,并對檢測體系進行了針對性優化,可針對鳥類羽毛、血液、組織及口腔/泄殖腔拭子等樣品中APV 的特異核酸片段進行PCR擴增,擴增產物可以直接進行瓊脂糖凝膠電泳,以進行結果判定。


實驗操作:

1. 樣本制備(樣本制備區)

請參照動物基因組DNA快速提取試劑盒(PCR分析用)說明書,或其他符合相關標準的核酸提取試劑盒/方法,對處理后的樣本進行核酸提取。提取的樣本核酸盡量及時進行檢測,放置于冰盒中,否則于 4℃或-20℃保存。

 

2. 配制反應體系(加樣區)

  •  按照樣本數量(n+2,n為樣本數,每次實驗建議設置 1 個陽性對照,1 個陰性對照)配制反應液,具體配制方法如下:分別吸取((n+2)*7.5µL無酶無菌水+(n+2)*10µL APV反應液+(n+2)*1µL APV引物Mix)加入潔凈離心管中,充分吹吸混勻,分裝至0.2mL PCR 管(離心管)中,每孔18µL(如樣本過多,可提前預制,于 2~8℃短暫保存,2 小時內使用)

 

  • 向反應液中依次添加 2μL無酶無菌水(陰性對照)、樣本核酸和APV陽性對照,蓋好 管蓋,做好記錄,反應總體積為 20μL。充分混勻,離心 30 秒后進行PCR擴增實驗。

 

3. PCR擴增(擴增及產物分析區)

95℃預變性 5 分鐘;94℃變性 45 秒,55℃退火 45 秒,72℃延伸 45 秒,共 35 個循環;72℃ 延伸 5 分鐘;4℃保存。擴增產物先放置于 4℃(-20℃約 5 分鐘)條件下充分冷卻(15 分鐘)


4. 瓊脂糖凝膠電泳(以水平電泳瓊脂糖凝膠制備為例)

  • 根據制膠量及凝膠濃度(1%~1.5%),量取一定量的電泳緩沖液,倒入三角錐形瓶中。

注:制膠緩沖液和電泳緩沖液需一致。

 

  • 準確稱量瓊脂糖,小心加入三角錐形瓶中。在錐形瓶的瓶口蓋上牛皮紙或封口膜,置

于微波爐中或電磁爐上加熱溶解。加熱至溶液沸騰后,請戴上防熱手套,小心晃動錐形瓶,如 此重復數次,直至瓊脂糖溶解。

注:瓊脂糖溶解過程采用多次短暫沸騰的方法,避免溶液過熱暴沸。保證瓊脂糖充分溶解,以免造成電泳圖像模糊不清。

 

  • 充分溶解的瓊脂糖稍冷卻后,加入適量核酸染料,輕微充分搖勻(避免產生大量氣泡)。

 

  • 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在 3~5mm之間。

 

  •  室溫下待膠凝固(大約 30 分鐘~1 小時),小心拔出梳子,將凝膠置于事前加入電泳緩沖液的電泳槽中,保證電泳緩沖液沒過凝膠。

 

  •  取 5μL DNA Marker以及 10μL經瞬時離心冷卻后的擴增產物,分別加入凝膠的各個點樣孔中,所有樣本點樣完成后,靜置 2 分鐘后,接通電泳槽電源,根據實際情況設置電壓(70~120V)及電泳時間(20-30 分鐘)。

 

5. 結果判定

  • APV陽性對照在 200bp左右出現擴增條帶,且陰性對照無目標擴增條帶,則結果成立。

  •  樣本檢測結果在 200bp左右出現一條擴增主條帶,表明待檢樣本中存在APV核酸,則

判定為APV陽性。

  • 樣本檢測結果無目標擴增條帶,表明樣本中未檢測出APV核酸,則判定為APV陰性。


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