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細胞培養(yǎng)過程中細胞質(zhì)控方案

來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司 2023年04月07日 10:03

正如人有喜怒哀樂，細胞也是如此，細胞的活力和狀態(tài)是不斷變化的，而非一成不變的。在細胞體外培養(yǎng)的過程中，離開機體保護的細胞是很脆弱的，在陌生的生長環(huán)境下即便是培養(yǎng)條件的輕微改變，也可能對細胞產(chǎn)生無法預(yù)估的影響。在原代細胞培養(yǎng)過程中，即使保持培養(yǎng)條件一致，在傳代過程中，細胞的存活質(zhì)量也是逐漸下降的。

以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC細胞）為例，HUVEC細胞是研究內(nèi)皮細胞功能的經(jīng)典體外細胞模型。在心血管疾病的研究中，主要用于研究內(nèi)皮細胞功能改變或損傷后其衍生細胞因子對血壓的影響；在腫瘤研究中，主要用于實體瘤中血管生成的研究。然而，HUVEC在傳代培養(yǎng)過程中，其活力是逐漸衰退的，因此細胞傳代最多不超過10代。

新鮮的HUVEC

衰老的HUVEC

傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)主要是通過顯微鏡下形態(tài)學(xué)變化以及傳代培養(yǎng)周期的變化預(yù)估細胞生長生存狀態(tài)。這種主觀判斷既無法量化，也無法進行統(tǒng)計學(xué)分析。因此，目前對細胞存活質(zhì)量的判斷并沒有準確、客觀的統(tǒng)一標(biāo)準，并且對體外培養(yǎng)細胞的存活質(zhì)量控制往往被科研工作者們“忽略”，從而導(dǎo)致實驗結(jié)果的不穩(wěn)定。

體外細胞的有效培養(yǎng)新概念——“細胞質(zhì)控”。通過細胞活力、細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖及DNA損傷五方面對細胞生長生存狀態(tài)進行監(jiān)控。

在這五個方面中，影響最大的便是細胞活力，下面咱們專門來談一談細胞活力如何判斷。在體外細胞培養(yǎng)的過程中，細胞總有一些因各種原因而死亡，總細胞中活細胞所占的百分比，即是我們常說的細胞活力?！凹毎|(zhì)控”中最基礎(chǔ)的指標(biāo)便是細胞活力。常見的流式細胞設(shè)備及部分細胞計數(shù)儀器都可以對細胞進行絕對計數(shù)，還可以提供準確、客觀的細胞活力數(shù)據(jù)，為“細胞質(zhì)控”提供準確、客觀的統(tǒng)計學(xué)依據(jù)，細胞活力評估并不困難！

滿足以下兩個條件就可以進行細胞活力檢測

1. 正常細胞的細胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一種核酸染料，常用于細胞凋亡(apoptosis)或細胞壞死(necrosis)的檢測和流式細胞儀分析。PI不能通過正常完整的細胞膜，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色，可以用來分辨壞死細胞/正常細胞。

2. 加入另一種可以透過細胞膜的核酸染料，就可以通過兩種染料將活細胞和死細胞區(qū)分開。

PI經(jīng)常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一起使用，能同時對活細胞和死細胞染色。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm。

細胞活力的技術(shù)標(biāo)準界定

應(yīng)用案例：納米藥物毒性測試

納米藥物的研究是近年來新藥研發(fā)的熱點。納米藥物載體篩選的首要標(biāo)準是檢測其對細胞的毒性。而在細胞毒性測試中，首先要排除的是基底培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的死細胞，即“噪音信號”。在對新型納米藥物載體SEONLA的研究中，Zaloga等人認為只有活細胞比例超過90%方可進行細胞毒性研究，細胞質(zhì)控的重要性由此可見一斑。

細胞毒性的入門級指標(biāo)是細胞活力。判斷一種物質(zhì)（化合物、小分子藥物或蛋白質(zhì)等）對細胞的毒性首先要觀察的是其是否或誘導(dǎo)細胞死亡，即細胞活力的變化。以維生素C為例，研究發(fā)現(xiàn)，高濃度維生素C對眼癌細胞Y79 Retinoblastoma Cells具有殺傷作用。文章中，作者以眼癌常用化療藥Melphalan作為對照，對經(jīng)過處理的細胞活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，維生素C對Y79 Retinoblastoma Cells殺傷作用逐漸增強，并且維生素C對眼癌細胞的殺傷作用優(yōu)于Melphalan。這一實驗結(jié)果為眼癌更安全、更有效的治療方案的提出提供了理論依據(jù)。

細胞質(zhì)控儀測得數(shù)據(jù)

除了細胞毒性研究，細胞質(zhì)控在病毒感染或者RNA轉(zhuǎn)染的研究中也是非常重要的。在這一類研究中，轉(zhuǎn)染/感染試劑或多或少都會對細胞有一定殺傷作用。因此，在轉(zhuǎn)染之前，活細胞需要達到一定的比例才可以保證在轉(zhuǎn)染之后有足夠數(shù)量的細胞進行后續(xù)的研究。而這一比例需要實驗條件摸索才能確定。

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